導語：如何才能寫好一篇色譜柱，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

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關鍵詞 離子色譜法；色譜柱；性能比較

中圖分類號O657 文獻標識碼A 文章編號 1674-6708（2013）102-0126-02

0 引言

離子色譜是高效液相色譜的一種，主要用于陰離子、陽離子的分析。對難以用其他儀器和方法分析的常見陰離子、陽離子、有機酸和有機胺類等組分的分析，離子色譜法也具有選擇性好，靈敏、快速、簡便，同時測定多組分的優點。

離子色譜的最重要的部件是分離柱。柱管材料應是惰性的，一般均在室溫下使用。分離柱的填料由基質和功能基兩部分組成。作為填料的基質可分為有機聚合物基質和無機（硅膠、氧化鋁）基質兩大類。其中有機聚合物離子交換樹脂應用較廣，是目前商品化分離柱的主要填料。高性能分離柱的有效性，是離子色譜發展的關鍵。

本實驗是針對國產的陰離子柱對于常見七種陰離子的分離效能與美國戴安公司的陰離子柱的柱效進行比較，藉以了解國內與國外離子色譜技術的水平。

1試驗部分

1.1儀器和試劑

1.2溶液和淋洗液的配置

1.2.1濃度為1000ppm儲備液的配置

1.2.2濃度為10ppm單標的配置

1.2.3混標的配置

1.2.4淋洗液的配置

1.3色譜條件

2 結果與建議

2.2 結果

從圖1與圖2中能看出國產SH-AC-1樣品的保留時間要大于戴安色譜柱。SH-AC-1需要22min才能完全出峰，戴安的15min能完全出峰。從表1與表2中能看出國產色譜柱對各峰的保留時間長和理論塔板數偏低。國產SH-AC-1色譜柱F離子和水負峰分離不開，H2PO4與Br分離度小于1.5，戴安的色譜柱的柱效要比國產色譜柱的柱效要好。

2.3 建議

1）與國外的色譜柱的柱填料相比國產柱的柱填料應做哪些改進；

2）與國外的色譜柱的柱內徑相比國產柱的柱內徑能更小為好；

3）若國產柱的柱壓與總電導與戴安的離子柱一樣，這樣對F離子與水負峰的分離與H2PO4與Br分離度是否會更好，柱效會有所提高。

參考文獻

[1]ISO/IEC17025-1999.General Requirement for the Competence of Galibration and Testing Laboratories [S].

篇2

[關鍵詞] 牛血清白蛋白；生物色譜柱；阿司匹林

[中圖分類號] R96[文獻標識碼] B[文章編號] 1673-7210（2014）06（a）-0101-04

Preparation of bovine serum albumin biological chromatographic column and its application in determination of Aspirin

TANG Lingli1 WEI Shibai2 HUANG Dongping1 HUANG Mingli1 RUAN Chong1

1.College of Public Health of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China; 2.Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China

[Abstract] Objective To prepare biological chromatographic column to separate and determine the ingredients of drugs. Methods Silica gel was reacted with 3-aminopropyl trimethoxylsilane to form amine functionalized activated silica gel, which was covalent binding with BSA to synthesize BSA bonded stationary phase. Then BSA bonded stationary phase was packed column with homogenization, thus BSA biological chromatographic column was prepared. Aspirin was taken as a detective object to examine the combination performance and separation performance of BSA bonded stationary phase. Results It came to that, the combined rate was 3.69 μmol/g, the biological chromatographic column was 74 mg/g, the amount of Aspirin in per tablet was 14.65 μg and the labeled amount was 107.8% detected by BSA biological chromatographic column. Conclusion All of above shows that BSA bonded stationary phase is synthesized successfully, and the BSA biological chromatographic column has good combination property and separation property.

[Key words] Bovine serum albumin; Biological chromatographic column; Aspirin

牛血清白蛋白色譜柱的制備

及對阿司匹林的

1.廣西醫科大學公共衛生學院，廣西南寧 530021；2.廣西醫科大學第一附屬醫院藥學部，廣西南寧 530021

[摘要] 目的 制備生物色譜柱，用于分離或測定藥物成分。 方法 采用3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTS）與硅膠反應生成氨基功能化的活化硅膠，并與牛血清蛋白（BSA）共價結合形成BSA鍵合固定相，勻漿裝柱制備成BSA生物色譜柱，以阿司匹林（Aspirin，ASP）為分析對象考察BSA固定相的結合性能和分離性能。 結果 BSA結合率為3.69 μmol/g，ASP在BSA鍵合固定相色譜柱上的最大結合量為74 mg/g，經BSA色譜柱測得阿司匹林腸溶片的含量為14.65 μg/片，標示量為107.8%。 結論 這表明BSA與硅膠載體成功結合形成BSA鍵合固定相，所制備的BSA生物色譜柱具有良好的結合性能與分離性能。

[關鍵詞] 牛血清白蛋白；生物色譜柱；阿司匹林

[中圖分類號] R96[文獻標識碼] B[文章編號] 1673-7210（2014）06（a）-0101-04

Preparation of bovine serum albumin biological chromatographic column and its application in determination of Aspirin

TANG Lingli1 WEI Shibai2 HUANG Dongping1 HUANG Mingli1 RUAN Chong1

1.College of Public Health of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China; 2.Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China

[Abstract] Objective To prepare biological chromatographic column to separate and determine the ingredients of drugs. Methods Silica gel was reacted with 3-aminopropyl trimethoxylsilane to form amine functionalized activated silica gel, which was covalent binding with BSA to synthesize BSA bonded stationary phase. Then BSA bonded stationary phase was packed column with homogenization, thus BSA biological chromatographic column was prepared. Aspirin was taken as a detective object to examine the combination performance and separation performance of BSA bonded stationary phase. Results It came to that, the combined rate was 3.69 μmol/g, the biological chromatographic column was 74 mg/g, the amount of Aspirin in per tablet was 14.65 μg and the labeled amount was 107.8% detected by BSA biological chromatographic column. Conclusion All of above shows that BSA bonded stationary phase is synthesized successfully, and the BSA biological chromatographic column has good combination property and separation property.

[Key words] Bovine serum albumin; Biological chromatographic column; Aspirin分子生物色譜法（MBC）是20世紀80年代中后期逐漸發展起來的以酶、受體、抗體、傳輸蛋白等生物大分子為固定相的一類色譜法，是基于生物大分子的特異性相互作用原理進行分離純化具有活性的化合物或測定生化參數的一項新興技術[1]。藥物作為一類重要的生物活性物質與血漿蛋白存在可逆性的結合平衡，藥物分子通過血漿白蛋白的運輸到達受體部位發生藥理作用，而藥物分子在體內與血漿蛋白的相互作用是其發揮藥理作用的前提，因此可以通過血漿白蛋白生物色譜篩選藥物中的活性成分。付強等[2]通過自制人血清白蛋白色譜柱成功對DL（±）色氨酸進行了手性分離；Bentucci等[3]制備出的血清白蛋白色譜柱，不僅可篩選出藥物活性成分，還可通過體外實驗反映藥物-血清白蛋白的相互作用。蔡漢寧等[4]制備出核心組蛋白色譜柱作用于其活性物質，至少篩選出9種組蛋白作用蛋白。與傳統的實驗方法相比，分子生物色譜法具有高度專一性、分離速度更快、容易自動化操作、重復性好等優點[5]。

由于人血清白蛋白價格昂貴，用于制備生物色譜柱成本太高，有學者利用牛血清白蛋白與人血清白蛋白結構相似的特點，制備成牛血清白蛋白色譜柱用于中藥活性成分的分離測定。Tan等[6]通過制備的牛血清蛋白生物整體柱，成功的分離出當歸的活性成分，并考察了當歸提取液在該整體柱上保留的影響。本文主要通過將硅膠氨基功能化與BSA共價鍵結合合成BSA固定相，制備BSA生物色譜柱，并選擇了阿司匹林（ASP）作為與BSA結合的對象來驗證BSA色譜柱的性能。ASP作為一種代表性藥物，不僅具有卓越的消炎、退熱、止痛能力，研究表明它還可以協同干擾素抑制肝細胞癌生長轉移[7]，抑制宮頸癌Hela細胞增殖[8]，預防妊娠期高血壓[9]等。通過對ASP及其腸溶片的分離測定，可以進一步探討生物色譜柱在藥物有效成分分離測定中的應用前景。

1 儀器與材料

6010紫外可見分光度計（安捷倫科技公司，上海）；LC-10Tvp高效液相色譜儀（日本島津公司）；spectrum 100傅立葉變換紅外光譜儀（美國penkim Elmer儀器有限公司）；Bio-Rad垂直電泳槽、電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTS）（97%，上海晶純試劑有限公司，批號：15122）；N，N′-琥珀酰亞胺碳酸酯（98%，阿拉丁公司，批號：25231）；考馬斯亮藍G250（沃凱，批號：WB20091102）；BSA（Solarbio）；硅膠Sepra Silica （粒徑50 μm，phenomenex 美國）；ASP標準品（Purity>99%）；ASP腸溶片（50 mg/片，國藥準字H43021814）；四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺溶液、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸胺、Tris堿、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）均來自北京索萊寶。

2 方法與結果

2.1 BSA色譜柱的制備

取硅膠2 g（平均粒徑為50 μm，孔徑46 Å（1 Å=0.1 nm），比表面積為518 m2/g），加入適量甲苯回流除去殘留水分，按10 μmol/m2加入3-氨丙基三甲基硅烷反應8 h得到氨丙基硅膠，過濾，分別用甲苯和甲醇洗滌，真空干燥后置干燥器保存。取氨丙基硅膠2 g，加入乙腈5 mL和N，N′-琥珀酰亞胺碳酸酯2 g，于30℃反應24 h，過濾后分別用乙腈、甲醇洗滌得到活化硅膠。取制備得的活性硅膠1.5 g，加入到25 mmol/L（pH=6.6）的磷酸鹽緩沖液中，再加入適量BSA，30℃下攪拌反應20 h，過濾后依次用水及5%乙醇多次洗滌，得到BSA固定相。將制備好的BSA固定相用緩沖液勻漿后注入不銹鋼柱（4.5 nm×150 nm）中，并抽真空壓緊柱，制備得到BSA色譜柱。

2.2 傅里葉紅外光譜（FTIR）驗證活化硅膠功能基團

用溴化鉀壓片法制備活化硅膠樣品，進行FTIR分析。FTIR分析結果見圖1，硅膠（a）和活化硅膠（b）共有的吸收峰有：1099、1103 cm-1處的非對稱伸縮振動，指紋區800 cm-1的對稱伸縮振動和470 cm-1的彎曲振動，均為硅膠的主要結構Si-O的特征譜帶；與硅膠（a）相比，活化硅膠（b）增加了伯胺（-NH2）的吸收峰1402、1561 cm-1，2928 cm-1峰為亞甲基的不對稱變形振動峰，說明硅膠上中有亞甲基的存在，表明APTS已結合在硅膠上。由此可見，活化硅膠成功連接上了氨基功能基團。

a.硅膠；b.活化硅膠

圖1 硅膠和活化硅膠的紅外光譜圖

2.3 BSA與活化硅膠結合量

按硅膠與BSA質量比8∶1、4∶1、2∶1、1∶1進行表面覆蓋率的測定。稱取四份硅膠，每份0.5000 g，分別與0.0625、0.1251、0.2500、0.5000 g BSA反應，反應結束后各取100 μL洗滌液采用考馬斯亮藍染色法[10]測定其中BSA含量，用BSA加入量與反應剩余BSA量之差計算出結合量，按照下列公式計算出BSA的表面覆蓋率：表面覆蓋率=結合蛋白的物質的量（μmol）/活化硅膠質量（g）。結果顯示，活化硅膠與BSA質量比為4∶1時，BSA結合量已基本達到飽和，加大劑量并不能明顯的增加鍵合量，表明BSA表面覆蓋率可能受空間位阻大小的影響。見圖2。

圖2 活化硅膠與BSA不同配比下的BSA表面覆蓋率

2.4 BSA固定相結合ASP研究

精密稱取ASP對照品50 mg，用冰醋酸-甲醇（1∶10）溶液稀釋至50 mL，搖勻，得到ASP標準溶液。取ASP標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL用冰醋酸-甲醇（1∶10）溶液稀釋至10 mL，各取10 μL用于HPLC。色譜條件：流動相：甲醇-20%冰醋酸（3∶1）；流速：1 mL/min；色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；紫外檢測器，λ=237 nm。得到ASP標準曲線方程：Y = 97 941X+ 37 178，r = 0.9997，其中Y為峰面積，X為ASP濃度（μg/μL）。

稱取一定量的硅膠和BSA固定相勻漿法分別填裝于兩根柱子中，精密稱定適量的ASP，用中性乙醇溶解后緩緩傾注入色譜柱中，用蒸餾水洗滌柱子，接收洗滌液，根據標準曲線計算洗脫液中ASP含量，ASP加入量與洗脫液中ASP含量之差得到固定相對ASP的結合量，見圖3。對比硅膠固定相和BSA固定相對ASP的結合量，ASP與BSA固定相結合量明顯大于與硅膠固定相結合量，證明與ASP結合的主要是BSA而不是硅膠。

圖3 硅膠固定相、BSA固定相與阿司匹林結合量的比較

2.5 BSA色譜柱性能考察

篇3

Abstract: Filled chromatographic column meets the test requirements, but the chromatographic peak tailing phenomenon happens when testing. Changing the parameters and sample size, no significant improvement. Hollowing some distance at the intake end of filled chromatographic column, the chromatographic peak becomes normal and completely improved.

關鍵詞:色譜填充柱;柱效;探討;色譜峰

Key words: chromatography packed column;column efficiency;exploration;chromatographic peak

中圖分類號:S37文獻標識碼:A文章編號:1006-4311(2010)18-0248-01

1問題的由來

1.1 按GB/T 18415-2001《小麥粉過氧化苯甲酰測定方法》規定的溶劑和進樣量分別進樣2μl丙酮、石油醚(60℃~90℃沸程),在注溫240℃ 條件下,1.6min以后,出現溶劑峰,但嚴重拖尾。

1.2 改用6#溶劑油飽和蒸氣進樣0.2ml,18秒后,出現溶劑峰,是個很尖的峰,沒有出現拖尾。

為什么會出現以上現象,實驗開始時懷疑可能柱子老化不完全造成的,我們對玻璃填充柱進行了24小時老化,沒有任何改善。反復檢查安裝過程,沒發現任何異常。大連物化所提供的玻璃填充柱的質量是可靠的,我們又開始分析查找可能出現其它原因。

1.3 嘗試改變有關參數,逐步降低或提高柱溫,增大減小載氣流量,燃氣和助燃氣流量,又分別注射2μl丙酮、石油醚,溶劑峰拖尾現象無明顯改善,又分別加苯甲酸的丙酮溶液,進樣2μl,濃度分別為15μg/ml、20μg/ml時,在7分鐘后出峰,在國標準法標準曲線最小濃度5μg/ml、10μg/ml,注射2μl,基本不出峰(或峰形不明顯)。這樣的情況顯然無法滿足工作需要,基本不能工作。

1.4 改變進樣量,分別以1μl,0.5μl丙酮進樣,溶劑峰峰形明顯好看,又以同樣的進樣量加入20μg/ml的苯甲酸標準溶液,溶劑與樣品峰出現分離,但樣品峰較小,其中進樣1μl時,濃度為20μg/ml 以上濃度的苯甲酸丙酮溶液,色譜峰有響應值;進樣量為0.5μl,只有40μg/ml以上濃度的苯甲酸丙酮溶液時才有響應,分離效果還可以,因此可以說明色譜柱本身填充質量問題不大,只是由于進樣量的減少,標準物質(苯甲酸)要很大濃度才有響應,無法滿足工作需要,按國家標準來看,已經沒有實際意義了,顯然必須進行改進。

1.5 經分析,可能是樣品汽化過程有問題,會不會是汽化空間過小,出現類似死體積過大原因導致拖尾,于是嘗試將柱子進氣端進行一些掏空,掏空1mm后,以2μl丙酮進樣試驗,峰形有較大改善,筆者又繼續掏空1mm后進行實驗,峰形完全改善,恢復正常,用石油醚實驗,情形大體相當。于是又用苯甲酸丙酮標準溶液進樣,測試最低檢出限,完全達到工作需要,恢復正常。

2原因分析

2.1 據資料介紹,拖尾峰的產生大致有這么幾種 :即色譜柱安裝位置不正確;柱子進樣口污染;溶劑極性不匹配;溫度過高;柱子液相流失等等。經分析和認真檢查,在減小進樣量后,獲得明顯效果,于是進行少量挖空試驗。

2.2 樣品進入色譜柱之前,樣品有一個汽化過程,在240℃條件下迅速汽化,由于色譜柱汽化空間較小,在較短時間內樣品汽化后體積較大,不能及時隨載氣完全進入色譜柱,造成一部分死體積過大,樣品進入柱子時間無法保持一致,分離過程不能同時進行,是一段一段地進入柱子進行分離,即使填充物完全合格也不會清晰的分離,最后就是出現大拖尾峰形。

2.3 使用6#溶油氣體進樣正是由于體積相對小得多就表現出正常狀態,進一步說明了實驗所用溶劑是由于汽化不完全,無法正常隨載氣進入到色譜柱,形成較大的死體積造成了拖尾現象的出現。

2.4 由于樣品隨溶劑進入色譜柱,按一定比例保留一部分在過大的死體積內,所以在出峰部位(樣品保留時間)的樣品量過少,響應值就很低,而且沒有辦法保證重復性。這樣的結果既降低檢出限,又不能保證準確定量。因此會出現大濃度標準樣品注入會出峰,而小濃度標準樣品卻不能出峰或出峰很小的情況。

2.5 通常情況下,每提高柱溫30度,可以使分配系數減少一半,這樣是可以使前述實驗中的溶劑峰形稍顯好看一些,但卻不能改善柱效,溫度過高,一些液相會流失,因此在工作中不能過大隨意改變溫度,一定要在最高和最低溫度之間進行測試。降低柱溫可以改善分離效果,但不會改變拖尾現象,通過實驗,溫度改變和氣流改變確實對溶劑峰拖尾情況沒有改善。

3結論

3.1 根據氣色譜的塔板理論,塔板數越高分離效果越好,色譜柱一旦裝好,柱的塔板數在一定條件下是不會變化的,通過改變進樣量,不能提高柱效,相反過多的進樣量,可能對色譜柱有污染,從而降低柱效,我們在開始出現的現象,在客觀上就相對地“加大”了進樣量,從而造成原有的塔板無法滿足對樣品成分的分離作用,造成進樣口樣品堆積,就相當于反復注入樣品,一次次從頭層析,重新分離,無法實現干凈的環境和準確的進樣量,不能如實地反映出一組樣品組分在柱子中的行進情況。

3.2 根據氣相色譜的條件和國家標準方法規定,我們的進樣量應控制在一定的范圍內,一般液體樣品要在0.1-5μl,氣體在0.1-10ml之間,太低或太高的進樣量都可能改變標準方法的檢出限,是不可取的。因此采用減少進樣時來改變圖形效果沒意義。

3.3 分析本實驗出現的現象,我認為,正是色譜進樣端汽化腔過小,樣品來不及完全汽化或者汽化后無法一次進入柱子,造成溶劑峰的假拖尾現象,改變柱溫,無論增高或降低都沒有改善效果,是因為沒有解決問題的實質,通過減小進樣量,能夠改善峰形恰恰說明了這一問題,由于增大進樣端汽化腔,滿足了全部汽化所需空間條件,而明顯改善了圖形效果。根據塔板理論,我們所用的柱子塔板數在2000-3000以上,進樣前端少量掏空,對塔板影響不是很大,實驗結果也能體現出保證分離能力,是可行的。

3.4 將色譜柱的進樣少量掏空實驗,這和毛細管色譜柱將進氣端適量剪切方法差不多,可以在適當的情況下分析使用,也可以用來處理使用時間較長,可能有少量污染情況下的柱子,具體掏空多少,如何掏,應通過實驗來慢慢進行,只要夠達到分離效果,檢出限也能達到要求就可以進行嘗試。

參考文獻:

[1]H?M?麥克奈爾,E?J 博內利.氣相色譜基礎[M].林炳承,譯.北京:人民教育出版社,1979.

篇4

【摘要】 建立了高效液相色譜串聯質譜(HPLCMS/MS)測定豬肉樣品中新型獸藥泰拉霉素殘留的方法。樣品用V(甲醇)∶V(0.1% H3PO4)=70∶30混合溶液提取，經離心后用PCX固相萃取小柱凈化， 以SymmetryC8色譜柱為分離柱，在串聯質譜多反應監測(MRM)模式下檢測，內標法定量。方法的線性范圍為10～500 μg/kg，檢出限為5.0 μg/kg，在3個濃度水平(10，20和50 μg/kg)進行添加實驗，平均回收率為93.1%～105.5%; 批內相對標準偏差為1.5%～4.6%; 批間相對標準偏差為1.8 %～5.6%。

【關鍵詞】 高效液相色譜串聯質譜， 豬肉， 泰拉霉素， 殘留

1 引 言

泰拉霉素(Tulathromycin)是一種新近上市且為動物專用的大環內酯類半合成抗生素，分子式為 C41H79N3O12(分子量806)，其分子結構如圖1所示。我國農業部在2008年第957號公告中首次批準使用泰拉霉素。泰拉霉素主要用于放線桿菌、支原體、巴氏桿菌、副嗜血桿菌引起的豬、牛的呼吸系統疾病。具有用量少、一次給藥、低殘留、動物專用等優點[1，2]。我國廣泛使用的大環內酯類藥物為泰樂菌素和替米考星，雖然這兩種藥物的使用效果良好，但隨著使用時間的延長， 圖1 泰拉霉素分子結構式

Fig.1 Structure of tulathromycin在很多地區出現了不同程度的耐藥性[3]，而泰拉霉素藥效強于泰樂菌素、替米考星和氟苯尼考等市場廣泛使用的大環內酯類藥物，因此，泰拉霉素必將在畜禽生產中大量使用。作為一種新藥，泰拉霉素的殘留檢測方法的研究尤為必要。目前，大環內酯類藥物殘留檢測方法有ELISA篩選法[4]、薄層色譜法[5]、氣質聯用法[6]、高效液相色譜[7～10]和高效液相色譜串聯質譜法等[11，12]。有關泰拉霉素的殘留檢測研究較少[13]。本研究建立了以羅紅霉素(C41H76N2O15， 837)為內標的泰拉霉素的HPLCMS/MS檢測方法，方法的定量限為10 μg/kg，可以滿足有關法規對大環內酯類藥物的檢測要求，為動物組織中泰拉霉素的殘留監控提供技術支持。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Waters 2695 Quattro MicroTM API高效液相色譜串聯質譜儀(美國Waters公司);固相萃取儀(美國Supelco公司);PCX固相萃取柱(3 mL， 60 mg， Agela公司);T25B組織勻漿機(德國Ika公司);RE120旋轉蒸發儀(瑞士Buchi公司);MS1Minishaker旋渦混合器;EEVAP水浴氮氣吹干儀(美國Organomation公司);超純水器(美國MilliQ公司)。

泰拉霉素標準品與羅紅霉素內標(Sigma公司)、乙腈、甲醇、H3PO4為色譜純;甲酸、KH2PO4、　NH3·H2O為分析純;實驗室用水為MilliQ高純水。

2.2 標準溶液的配制

泰拉霉素標準儲備液：準確稱取泰拉霉素10.0 mg，用V(0.05 mol/L K2HPO4)∶V(乙腈)=75∶25(pH 6.0)定容至10 mL，搖勻，置冰箱冷藏儲存，有效期3個月。內標物羅紅霉素的配制方法同泰拉霉素。

添加溶液的配制：吸取儲備液1 mL于100 mL容量瓶中并用V(0.05 mol/L K2HPO4)∶V(乙腈)=75∶25(pH 6.0)混合液定容，再從中吸取1 mL于50 mL容量瓶中得添加液濃度為0.2 mg/L(冰箱冷藏儲存，有效期2個月)。

2.3 內標物質的確定

由于大環內酯類藥物的同位素內標物質很少， 至今無泰拉霉素同位素內標物出售。而測定大環內酯類藥物的檢測方法研究和標準修制訂一般采用外標法或者采用大環內酯類某種結構相似藥物作為內標物來進行定量分析。本實驗選用一種沒有用于獸藥用途且結構與泰拉霉素非常相似的大環內酯類藥物羅紅霉素作為內標， 分子結構如圖2所示。 圖2 內標物羅紅霉素分子結構式

Fig.2 Structure of roxithromycin as internal standard

2.4 供試樣品溶液的制備

稱取2.0 g組織樣品于50 mL聚四氟乙烯塑料管中，加入10 mL提取液(V(甲醇)∶V(0.1% H3PO4)=70∶30)和適量內標工作液，7800 r/min勻質1 min后，5000 r/min離心2 min，收集上清液過已經分別用3 mL甲醇和3 mL提取液潤洗過的60 g/3 L的PCX小柱，待全部過柱后，再用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，最后用4 mL 4%氨化甲醇洗脫，50 ℃水浴氮氣吹干后用1 mL流動相定容，進行HPLCMS/MS分析。

2.5 LCMS/MS分析條件

SymmetryC8柱(20 mm×3.9 mm， 5 μm)，流動相：V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水溶液)=70∶30;柱溫：30 ℃，進樣室溫度15 ℃，進樣量：10 μL，流速為0.3 mL/min。

ESI(+); 多級反應檢測(MRM); 毛細管電壓： 4.2 kV; 錐孔電壓： 20 V; RF透鏡電壓： 0.2 V; 離子源溫度： 110 ℃; 脫溶劑氣溫度： 350 ℃; 錐孔氣流速： 50 L/h; 脫溶劑氣流速： 600 L/h; 倍增器電壓： 650 V; 二級碰撞氣： 氬氣。

3 結果與討論

3.1 樣品的提取和凈化

泰拉霉素含3個堿性的氨基基團，為弱堿性化合物，易溶于酸性溶液和極性溶劑中，在pH 6～8的水溶液中較穩定，在酸性(pH9)條件下均不穩定。對泰拉霉素殘留的提取和凈化方法的設計主要依據其弱堿性、脂溶性和酸不穩定性。據文獻[3]報道， 乙腈和甲醇是組織中大環內酯類藥物常用的提取溶劑，且采用酸化的乙腈或甲醇為提取溶劑可促進大環內酯類抗生素從組織中溶出， 改善提取效率。本實驗比較了4種提取液：乙腈0.1%偏磷酸(70∶30， V/V)、甲醇0.1%偏磷酸(70∶30， V/V)、乙腈0.1%磷酸(70∶30， V/V)和甲醇0.1%磷酸(70∶30， V/V)對泰拉霉素的提取效果。結果表明，甲醇0.1%磷酸(70∶30， V/V)提取液對泰拉霉素的提取效果較好，回收率高于其它提取液，故本實驗選擇甲醇0.1%磷酸(70∶30)為樣品提取液。液液分配(LLE)和固相萃取(SPE)是大環內酯類藥物的兩種主要凈化手段。液液分配操作比較麻煩且回收率相對較低， 重復性較差，所以本研究采用固相萃取技術凈化。比較了C18、Oasis MCX和PCX3種SPE凈化小柱， 由于Oasis MCX小柱和PCX小柱兼有陽離子交換和疏水作用機制，基于泰拉霉素的弱堿性和脂溶性的理化特性，Oasis MCX小柱和PCX小柱的凈化效果優于C18小柱。Oasis MCX小柱和PCX小柱提取效率沒有明顯差別，但PCX小柱成本低，所以，本方法選擇PCX小柱。

3.2 色譜與質譜條件的優化

3.2.1 液相色譜條件的優化 泰拉霉素是弱堿性和脂溶性的極性化合物，通過選擇不同規格、不同填料的色譜柱和調節流動相中緩沖溶液的pH值、離子強度和有機溶劑(如乙腈或甲醇) 的含量，從而控制泰拉霉素的離子化強度和溶解性，使其在色譜柱上獲得適當的保留和有效的分離。本實驗選用了SymmetryC8柱(20 mm×3.9 mm， 5 μm)，Venusil ASB C18柱(30 mm×2.1 mm， 5 μm)， XTerra MSC18柱(15 mm×2.1 mm， 3.5 μm)和XDBC18柱(50 mm×1.0 mm， 5 μm)4種不同規格、不同填料的色譜柱進行實驗。結果發現，選用SymmetryC8色譜柱時，基線平穩，峰形對稱，重現性好。流動相優化實驗發現，當流動相為V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水溶液)=70∶30等度洗脫時，可使泰拉霉素在SymmetryC8色譜柱上得到較好的分離效果和較高的靈敏度。

3.2.2 質譜條件的優化 根據泰拉霉素的分子結構的特征，選擇了ESI(+)為電離模式。通過流動注射直接進樣，對毛細管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量、RF透鏡電壓、質譜分辨率等條件進行了優化，并最終確定本方法質譜優化條件為：毛細管電壓 4.2 kV，錐孔電壓 20 V，RF透鏡電壓0.2 V，離子源溫度 110 ℃，脫溶劑氣溫度 350 ℃，脫溶劑氣流量600 L/h 。質譜圖見圖3，母離子、子離子以及定性、定量離子對見表1。表1 泰拉霉素的定性、定量離子

3.3 樣品基質效應的消除

電噴霧離子化( ESI)方法容易受樣品基質的影響。實驗發現， 樣品基質對離子化有非常強的抑制作用。為消除樣品基質效應，以待測樣品制備對應的空白樣品提取液，并以其作為標準溶液的稀釋溶液，可使標準和樣品溶液具有同樣的離子化條件。

3.4 方法學考察

3.4.1 方法的線性范圍與檢出限、定量限 在上述條件下，以基質添加標準曲線內標法定量(標準品色譜圖如圖4所示)，泰拉霉素質量濃度為10～500 μg/L時，線性關系良好，線性方程為Y=90.835X+0.187，(r=0.9993)。泰拉霉素的檢出限為5 μg/kg(S/N>3)，定量限為10 μg/kg(S/N>10)，超過了國內相關標準對大環內酯類藥物檢測的靈敏度要求。

圖4 羅紅霉素(A)內標物和泰拉霉素(B，C)的色譜圖

Fig.4 Chromatograms of roxithromycin (A) as internal standard and tulathromycin (B， C)3.4.2 方法的回收率與精密度 取適量空白豬肉，進行3個濃度水平(10，20和50 μg/kg)的添加回收實驗，每個水平取5個平行樣(添加和空白色譜圖見圖5)，結果見表2所示。方法的回收率為93.1%～105.5%; 批內相對標準偏差為1.5%～4.6%; 批間相對標準偏差為1.8 %～5.6%; 滿足了藥物殘留分析的要求。表2 方法回收率及精密度

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篇5

關鍵詞 定量結構-保留相關關系； 香精； 醛； 酮； 酯； 氣相色譜-質譜； 氣相色譜-紅外光譜

1 引 言

氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術結合了GC高效分離和MS定性專屬性強的優勢，具有靈敏度高、分析速度快和鑒別能力強的特點，可同時完成待測組分的分離鑒定，適用于混合物中未知組分的定性和定量分析，在食品[1]、環境[2]、醫藥[3]、化工[4]等領域中應用廣泛。但氣相色譜的色譜柱容量有限，同系物或異構體化合物的色譜保留時間相近或一致[5]。雖然GC-MS配置的NIST數據庫中已包含超過20萬張化合物的EI質譜圖譜，但在含有較多同系物和同分異構體的復雜樣品分析中，有些化合物在EI（與GC常聯用的離子化方式）電離方式下不產生分子離子峰；利用譜庫檢索一般只能給出某個成分的可能匹配物質，一些結構異構體的EI質譜圖較為相似，僅僅依靠GC-MS得到的結果對化合物進行定性并不十分充分，需要通過其它電離技術獲得分子量信息，或采用多級質譜（MSn）技術獲得結構信息。研究者常通過與其它定性方法聯用、建立指紋圖譜[6]或化學計量學[7]的手段來彌補NIST數據庫在同系物和異構體鑒定分析中的不足。氣相色譜-紅外光譜（GC-IR）聯用技術結合了GC良好的分離能力和IR結構鑒定的優勢，適合復雜未知物成分分離及其定性定量分析。另一方面，定量結構保留相關關系（QSRR）是直接利用分子結構信息關聯和預測有機物的色譜保留時間[8]。多元線性回歸模型是QSRR中應用廣泛的一種經典建模方法，它對自變量和因變量加以線性擬合得到最小二乘意義下的最佳結果，在環境、食品、化工等領域未知化合物的分離分析中得到廣泛應用[9～15]。

香精香料是食品香味的主要來源之一，它們使制造食品的香味能夠與傳統手工制作的食品相媲美。香精香料已經廣泛應用到食品生產的各個領域，它能改善食品質量、降低生產成本、增加食品的色香味，大大提高了人民的生活質量和品味，同時促進了食品工業的快速發展[16]。醛酮酯類化合物是重要的工業原料、藥物原料、合成中間體，也是合成香精香料的重要組成之一[17]。目前，醛酮酯類化合物的QSRR方面的相關研究已多有報道[18～24]。

本研究采用QSRR輔助GC-MS/IR方法快速定性分析飽和醛酮酯同系物及其同分異構體。以醛酮酯標樣保留時間tR為因變量，分子拓撲指數0Q為自變量，構建簡單醛酮酯類化合物定量結構-保留相關關系（QSRR），采用本方法輔助GC-MS/IR方法建立快速、準確的香精樣品中醛酮酯類化合物定性分析方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

GC 6890N氣相色譜（美國Agilent公司）；IR 6170紅外光譜聯用儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），另配有FID檢測器；6890/5790氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS，美國Agilent公司）。

2-戊酮、3-戊酮、2-己酮、4-庚酮、5-甲基-2-己酮、3-辛酮、正己醛、1-辛醛、丙酸乙酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸丙酯、丁酸丁酯、丁酸異戊酯、丁酸正戊酯、異戊酸異戊酯、丁酸己酯、乙酸戊酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、棕櫚酸甲酯、三醋酸甘油酯（純度≥99.5%，阿拉丁試劑公司）；正己烷（色譜純，百靈威公司（上海））。香精等樣品由某企業提供。

各標準品以正己烷為溶劑，配制成1000 mg/L儲備液備用；單標使用液和混標使用液根據需要由儲備液用正己烷稀釋而成。

2.2 分析條件

2.2.1 GC-MS條件

色譜柱： Agilent HP-VOC（60 m × 0.32 mm × 1.80 μm）； 進樣口溫度： 260℃； 質譜接口溫度270℃，離子源溫度230℃，電離方式為 EI，電子轟擊能量 70 eV；載氣為高純He，柱流速1.0 mL/min；進樣量1 μL，分流進樣，分流比為25∶1；程序升溫：以5℃/min的速率從70℃升至270℃。

2.2.2 GC-IR/FID條件 Agilent HP-VOC色譜柱 （60 m × 0.32mm × 1.80 μm）；進樣口溫度： 260℃，FID檢測器溫度：250℃；載氣為高純He，柱流速1.0 mL/min；進樣量1 μL，分流進樣，分流比為5：1；程序升溫：以5℃/min的速率從70℃升至270℃；紅外光譜分辨率：16 cm1，掃描次數：8次；GC-IR接口傳輸線溫度：270℃，光管溫度：270℃。

2.3 樣品處理

在0.2 mL香精樣品中加入0.5 mL 正己烷，振蕩2 min后，用1 mL 注射器吸取上清液，重復3次，得到1 mL萃取液，備用。

2.4 分子拓撲指數0Q

3 結果與討論

3.1 GC-MS和GC-FID/IR中醛酮酯化合物的保留時間

結合GC-IR可對未知物進行官能團鑒定的特點，輔助GC-MS定性分析復雜樣品中的醛酮酯類化合物。本研究首先考察了醛酮酯類化合物在不同方法中的色譜保留時間（表1）。結果表明，采用同一方法和同型色譜柱，由于GC-IR接口構造特殊，餾出物在氣紅接口中滯留時間較長，導致醛酮酯化合物在GC-MS和GC-IR/FID中保留時間不同，但色譜保留時間順序基本一致，相應化合物的保留時間差值近似為常數，這為GC-IR輔助GC-MS用于復雜樣品中未知物的分析鑒定奠定了基礎。

3.2 QSRR模型建立

將17種飽和酯類化合物分為兩類，其中7種乙酯類同系物（丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯）作為訓練集，推測對應關系式；剩余的不同取代基的其它酯類化合物作為預測集，用于檢驗方法準確性。飽和酯類化合物的Q值、在GC-MS方法中保留時間實驗值見表2。由表2可知，乙酯類同系物的色譜保留時間與其分子結構參數Q值間存在良好的線性關系，相關系數為0.997。由于這些乙酯類同系物都是直鏈羧酸基乙酯，在GC中存在良好的碳數規律。因此，本對應關系式與同系物碳數規律結果一致。此對應關系式對其它酯類化合物的保留時間預測值也列于表2。

由于作為預測集的酯類化合物與訓練集的乙酯類化合物的結構存在較大差異，單獨采用保留時間碳數規律無法得到良好的預測。但經過分子拓撲結構處理后的結果表明，酯類化合物的保留時間與其對應的Q值能很好地符合此線性關系，預測值與實驗值的偏差不超過5%。

對于醛酮類化合物，以2-戊酮、3-戊酮、2-己酮、4-庚酮及5-甲基-2-己酮作為訓練集，將醛酮化合物在不同方法上的色譜保留時間（tR）與相應化合物的0Q進行多元線性回歸分析。結果表明，tR與0Q具有良好的相關性，其相關系數R2=0.997。其中醛酮化合物在GC-MS方法中色譜保留時間（tR）與0Q的擬合方程為：

tR=0.9090Q-8.141（4）

以4-庚酮、3-辛酮、1-辛醛和4-壬酮為測試集，用公式（4）對測試集在GC-IR方法中的色譜保留時間進行預測，所得預測值及其與實驗值的相對偏差見表3。結果表明，測試集化合物的預測值與實驗值的相對偏差小于3.4%，表明模型預測能力較強。

3.3 QSRR輔助GC-MS/IR方法在復雜樣品醛酮酯類化合物鑒定中的應用

3.3.1 香精樣品1#分析 采用GC-MS分析香精樣品1#的正己烷萃取液（圖1A）。通過NIST質譜圖譜庫搜索，其中9、16、19和24號峰可能為醛酮類化合物，相應化合物及其匹配度見表4。

由圖1A可見，3號和16號譜峰的匹配度并不高，而24號譜峰不僅質譜匹配度低，而且給出了相似匹配度的不同化合物。本研究進一步采用GC-IR分析該樣品（圖1B），結合IR譜庫鑒定結果，可以基本確定譜峰9和19為醛酮類化合物，峰3為酯類化合物，但具體結構無法確定。

為了準確確定這些醛酮酯類化合物的同系物結構，采用QSRR模型進一步處理。表5給出了6～14個碳直鏈飽和醛的0Q值及其根據已知模型中擬合公式得到的色譜保留時間預測值。

為壬醛。而24號峰（十三醛和十四醛）相應的色譜保留時間預測值與實驗值相對誤差相當大，初步判斷MS譜庫推薦的兩個可能結果均不正確。根據保留時間預測值與實際色譜保留時間判斷，24號譜峰應為十一醛。通過標準樣品對預測結果進行核實， 3號峰為丁酸乙酯；16號峰為壬醛；24號峰為十一醛，證明采用QSRR結合GC-MS/IR能準

確判斷未知化合物的結構。

3.3.2 香精樣品2#分析 香精樣品2#經正己烷處理后的GC-MS分析結果見圖2，通過NIST質譜譜庫搜索給出的相應化合物及其匹配度見表6。

結果表明，雖然GC-MS NIST譜庫和GC-IR都顯示香精樣品2#中含有多個酯類化合物，但GC-MS對多個酯類化合物的同系物給出了匹配度相近的可能結果，單獨通過GC-MS或通過GC-IR輔助MS難以準確簡單酯類化合物同系物的結構。為此，本研究通過NIST推薦的化合物的0Q值并結合QSRR已建立的模型進行預測。結果表明，辛酸乙酯、十二酸乙酯、癸酸異戊酯和十五酸乙酯的預測保留時間與實驗中2， 8， 9和10號峰的保留時間吻合度較好，進一步采用相應標準樣品進行對比，最終確定預測結果與實際結果一致。

4 結 論

根據分子拓撲指數0Q和色譜保留時間關系，建立了醛酮酯類化合物的QSRR模型tR=0QA+B，該模型因變量、自變量具有較好的線性相關性，預測能力良好。采用GC-MS、GC-IR對香精樣品分離分析并進行初步定性，利用所建立的tR-0Q模型對初步定性結果輔助定性確定準確的定性結果，確立了快速、準確判定香精香氣等復雜樣品中未知化合物結構的分析方法。本方法中氣相色譜采用的色譜柱均為HP-VOC柱，在其它色譜柱體系，本方法并不適用。另外，本方法的tR-0Q模型對脂肪族飽和醛酮酯類化合物的能夠準確定性，但對苯系物或不飽和化合物的定性誤差較大。

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篇6

【摘要】 目的 建立脂肪中醋酸美侖孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮殘留量的測定方法。方法 色譜柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（65:35）；流速：1.0ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：292nm；進樣量：40μl。結果 樣品的室內加標平均回收率為86.7％～91.8％，室內相對標準偏差為4.5％～6.0％，室間加標平均回收率為81.4％～95.0％，室間相對標準偏差3.7％～7.1％，定量測定低限（LOQ）為10μg/kg。結論 本方法簡便，準確，可用于脂肪中醋酸美侖孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮殘留含量的測定。

【關鍵詞】 高效液相色譜法;脂肪;醋酸美侖孕酮;醋酸甲地孕酮;醋酸氯地孕酮

Determination of progestones in fat of beef and pork by HPLC

【Abstract】 Objective To establish the determination method of melengestrol acetate，chlormadinone acetate and megestrol acetate in fat of beef and pork.Methods Chromatographic separation was carried out on a C18column（250mm×4.6mm，5μm）and acetonitrile-water (65:35) as the mobile phase.The flow rate was 1.0ml/min; the column temperature was 35℃; the detection wavelength was 292nm; the injection volume was 40μl.Results The intra-laboratory average recoveries ranged from 86.7％～91.8％ and RSD of 4.5％～6.0％.The inter-laboratory average recoveries added to standard ranged from 81.4％～95.0％ and RSD of 3.7％～7.1％.The lowest limit of quantitation (LOQ) is 10μg/kg.Conclusion The method is simple and sensitive.It is suitable for the determination of melengestrol acetate，chlormadinone acetate and megestrol acetate in fat of beef and pork.

【Key words】 HPLC; fat; melengestrol acetate; chlormadinone acetate; megestrol acetate

醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮為合成的孕激素類藥物，有明顯的孕激素和抗雄激素作用，可抑制排卵。孕激素對垂體促性腺激素的釋放有一定的抑制作用，動物實驗表明有死胎率增加和致畸作用，副作用有：(1)惡心、頭暈、倦怠；(2)突破性出血；(3)孕期服用，會增加女性后代的男性化作用。孕激素類藥物能增強體內物質沉積和改善生產性能，可以很快產生顯著和直接的經濟效益，因此，對生產者有很大的吸引力。畜牧業中使用孕激素類藥物(非治療用途)已有很長的歷史，但人類長期食用含有激素的肉制食品，即使含量甚微，亦會明顯影響機體的激素平衡，而且有致癌危險，對幼兒造成發育異常等危害。因此，開發一種能檢測孕酮殘留量的方法是十分必要的。

檢測孕激素類藥物的方法有很多，如液相色譜/質譜法（LC/MS）［1］、氣相色譜/質譜法（GC/MS）［2，3］和液相色譜法［4～6］等。本文采用高效液相色譜法對牛和豬脂肪樣品中的孕酮進行檢測。

1 試劑與儀器

1.1 試劑 醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮標準品（Sigama公司），乙腈（HPLC級），甲醇（HPLC級），乙酸乙酯（HPLC級），其他試劑為分析純。水由Milli-Q凈化系統（Millipore公司）制得。

（1）標準儲備液：1000μg/ml，分別準確稱取0.050g醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮標準品于50ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用一年。

（2）混合中間溶液I：100μg/ml，分別吸取10.0ml醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮標準儲備液于100ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用一年。

（3）混合中間溶液II：1.0μg/ml，取1.00ml混合中間溶液I于100ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用半年。

（4）混合標準工作液：分別吸取10、20、40、80、100μl混合中間溶液II添加到980、970、950、910、890μl的乙腈-水（65:35）中，再加入10μl 0.2%鹽酸溶液，混勻，得到濃度為0.010μg/ml、0.020μg/ml、0.040μg/ml、0.080μg/ml和0.10μg/ml混合標準工作液，供液相色譜測定，當日使用。

1.2 儀器 Waters液相色譜系統，510泵體，486紫外-可見光檢測器，Emprower pro色譜軟件。氮氣吹干儀（Organomation Associates，Jnc.公司）；固相萃取裝置（Supelco公司）；低溫離心機（德國Eppendorf公司）；渦旋混勻器（XW-80A型，上海醫大儀器廠）；CN固相萃取柱（3ml，Waters公司）。

2 測定步驟

2.1 試樣的制備與保存

2.1.1 試樣的制備 把大約5g的豬或牛脂肪組織切成小塊，然后放入底部塞有玻璃棉的漏斗中，放入150ml的燒杯中，將燒杯置于微波爐內。根據所熬制脂肪量，使用最大功率，加熱30～60s，如果脂肪沒有融化，可在間隔30～60s以后重復加熱30～60s，直到有液體脂肪流出，通過漏斗滴入燒杯中。把熬制好的脂肪油放入樣品瓶中，密封，并做上標記。

2.1.2 樣品的保存 把熬制好的脂肪油樣品置于-18℃中，冷凍保存。

2.2 提取 稱取熬制好的脂肪油2.00±0.01g，置于50ml具塞離心管中，加入5ml乙腈，于60℃水浴中保溫3min以使固體脂肪溶化，渦旋振搖1min，在-5℃下離心7min（離心力1160g），吸取上清液至15ml帶塞聚丙烯離心管，再在沉淀物中加入5ml乙腈重復提取一次，合并上清液。在合并的乙腈提取液中加入2×2ml正己烷，渦旋振搖1min，于-5℃中離心5min（離心力1160g），棄去正己烷層。乙腈提取液于60℃中用氮氣吹干儀吹干，殘渣待皂化。

2.3 皂化 在殘渣（2.2項）中依次加入4ml正己烷、1ml 0.1mol/L 氫氧化鈉溶液和0.5ml1.0mol/L氯化鎂溶液，于渦旋混勻器上快速混勻10s，在60℃水浴中保溫15min，于-5℃中離心5min（離心力1160g），吸取上清液至15ml玻璃試管。在沉淀物中再加入4ml正己烷混勻后，在60℃水浴中加熱15min后，在-5℃中離心5min（離心力1160g），合并上清液。于60℃中用氮氣吹干儀吹干，用1.0ml正己烷溶解殘渣，待凈化。

2.4 凈化 將皂化后的樣液（2.3項）倒入經5ml乙酸乙酯和6ml正己烷預處理過的CN柱中，用2×1ml正己烷潤洗玻璃試管，洗液倒入到CN柱中。待樣液流過后，依次用5ml正己烷和6ml 5%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗柱子，隨后打開真空泵將小柱中液體抽干，保持抽氣2min。最后用3.5ml 20%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脫，洗脫液收集于15ml玻璃試管中，于60℃中用氮氣吹干儀吹干。殘余物用990μl乙腈-水（65:35）渦旋溶解，靜止15min后，加入10μl 0.2%鹽酸溶液，混勻，供液相色譜測定。

2.5 測定

2.5.1 液相色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；預柱：C18柱（12.5mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（65:35）；流速：1.0ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：292nm；進樣量：40μl。

2.5.2 液相色譜測定 根據樣液中3種孕酮的含量情況，選定濃度相近的標準工作液，標準工作液和樣液中3種孕酮的響應值均應在儀器檢測的線性范圍內。標準工作液和樣液等體積參樣測定。在上述色譜條件下，標準品的色譜圖見圖1。

圖1 醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的色譜圖（100ng/ml）1-醋酸甲地孕酮，2-醋酸氯地孕酮，3-醋酸美侖孕酮

3 結果與討論

3.1 線性范圍 醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮濃度在0.010～0.10μg/ml范圍內，峰面積與濃度呈良好的線性關系，其相關系數（γ2）均大于0.998。

3.2 回收率、精密度和定量檢測限 本實驗以2種脂肪（牛脂肪和豬脂肪）作為樣本。取適量標準品加入到2.0g樣品中，使添加量相當于10、20和50μg/kg，每個添加水平各取24份試樣（每種脂肪各12份）。圖2為空白脂肪樣品和添加樣品（10μg/kg）的色譜圖。表1為醋酸美侖孕酮，醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮外標法測得的室內回收率和精確度。表2為8家實驗室的室間回收率和精確度結果。根據回收率試驗，能可靠測得的最低濃度確定定量檢測限（LOQ），LOQ為10μg/kg，滿足殘留限量的檢測要求。

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篇7

實驗方法試劑與藥品

本實驗中豬肉由本地市場采購。所有試劑都是質譜純級，高效液相純級或分析純級。乙腈和水由Scharlau公司提供。乙酸乙酯、異丙醇由Fisher公司提供。標準物均采購自國家藥品生物制品檢定所(NICPBP)，以甲醇配制單個標準溶液(1.0mg／mL)，并在4℃下冷藏。以甲醇－水(10：90)配制合并工作溶液(10μg／mL)，并在4℃下冷藏。添加溶液應每周配制，以適當稀釋合并工作溶液來制備。

設備與材料

安捷倫1200高效液相色譜系統，安捷倫6460三重四極桿液相色譜一質譜／質譜聯用系統，安捷倫SamliQ SCX聚合物柱，50×3mL管，60mg(部件號：5982－3236)，安捷倫ZORBA×EcipsePlus C18色譜柱，50×2.1mm，1.8μm(部件號：959741-906)，安捷倫真空歧管處理盒(部件號：5982-9120)。

樣品制備

液－液提取：于1.5mL帶蓋聚丙烯管中稱取2g豬肉(精確至±0.01g)。加入8mL0.2M的乙酸鈉(pH值5.2)溶液，并渦旋以混合均勻。然后加入β2－葡萄糖醛酸酶(1000U／mL)100μL，并渦旋混合2分鐘。樣品在37℃下水解16小時，水解產物經震動處理15分鐘后，在離心機中用4000 rpm的速度離心分離10分鐘。取4m上層清液至另一離心管中，加入5mL、0.1 M高氯酸溶液并調節pH值至1±0.3，再在離心機中以4000 rpm的速度離心分離10分鐘。將上層清液移至另一試管中，用10M氫氧化鈉溶液調節其pH值至11。

于樣品試管中分別添加10mL飽和氯化鈉溶液和異丙醇一乙酸乙酯(60：40)混合液，并震動處理5分鐘。以4000 rpm離心分離5分鐘后，將有機層仔細轉移至另一離心管中。將異丙醇一乙酸乙酯混合液的添加、震動處理，離心分離和轉移有機液層的過程重復兩次，并將所有上清液合并。樣品于40℃以氮氣吹干，并將殘留物復溶于5mL、0.2M的乙酸鈉(pH值5.2)溶液中。該樣品將用于固相萃取純化。

固相萃取

固相萃取過程(SPE)如圖1中所示。先用3mL甲醇活化安捷倫SampliQSCX柱，然后用3mL水平衡。取5mL樣品溶液載入到柱中，并以重力通過色譜柱(約1 mL／min)。用2mL水和2mL、2％甲酸水溶液；中洗SPE／小柱，丟棄所有洗脫液。真空抽干SPE／小柱。最后以5mL、5％氨甲醇溶液洗脫，流速約為1mL／min。洗脫液于40℃氮氣吹干，殘留物復溶于1mL、0.1％甲酸的水／乙腈(90：10)溶液。樣品經渦旋混合和超聲波處理以完全溶解后轉移至1.5mL離心管中，并在3000 rpm條件下處理5分鐘。最后將樣品轉移至2mL的色譜小瓶中等待分析。

儀器條件

高效液相色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX EcllpsePlus C18色譜柱，50×2 1mm，1.8μm(部件號959741-906)，

流速0.4mL／mln；

柱溫40℃：

進樣體積：5μL：

流動相：水(0.1％甲酸溶液+2mM乙酸銨，A)；

乙腈(0.1％甲酸，B)；

梯度淋洗：

質譜條件

在正極模式下對4種化合物進行了監測。離子源條件如圖2所示，多反應監測通道如表2中所示。

結果與討論線性與檢測限

實驗中標準工作曲線(0.2b、0.5、1.0，2.0和5.0ng／g)是以添加適量混合工作溶液于空白基質來配制的。空白基體是通過將豬肉進行水解、液液萃取和固相萃取來制備的。校準曲線的結果如表3中所示。檢測限(LOD)定義為每個化合物給出信噪比(S／N)大于3:1時的濃度。各化合物的檢測限也列于表3中。

回收率與重現性

在豬肉中分別添加標樣濃度為0.5、1.0、2.0ng／g，計算回收率和重現性。每個濃度重復分析6次。回收率和重現性數據列于表4中。添加豬肉萃取物(1.0ng／g)的色譜圖如圖3中所示。

結論

篇8

關鍵詞 超高效液相色譜.串聯質譜法； 痕量殘留； 豬尿液； 瘦肉精

1 引 言

“瘦肉精”（Lean meat agents）最早是鹽酸克倫特羅的俗稱，現在泛指一類可以促進動物生長，提高瘦肉率的藥物[1]，主要包括鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、苯乙醇胺A、氯丙那林等β.受體激動劑，以及近年來監測發現的賽庚啶、可樂定等具有促進動物生長、提高飼料轉化率的化合物[2]。由于上述藥物在動物性食品中的極易殘留，會對食用者產生系列毒副作用，因此，包括我國在內的許多國家和國際組織已經制定了極其嚴格的規定。到目前為止，我國已明確禁止在食品動物養殖過程中使用克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、苯乙醇胺A、氯丙那林、多巴胺、班布特羅、齊帕特羅、馬布特羅、西馬特羅、溴布特羅、福莫特羅/阿福特羅、特布他林、賽庚啶、可樂定共15種具有促進動物生長、提高瘦肉率的藥物[1]。

近年來，我國加大了對明令禁止的上述15種“瘦肉精”非法使用的打擊力度，“瘦肉精”藥物在畜禽養殖中的非法使用得到了有效遏制，然而具有促進動物生長、提高瘦肉率功效、而未被列入國家禁用藥物名單的β.受體激動劑同系物或衍生物（如克羅潘特、羥甲基克倫特羅、克倫丙羅、西布特羅、妥布特羅、馬噴特羅、噴布特羅、卡布特羅、丁酚胺、利托君、克倫己羅、克倫塞羅、異克倫潘特、溴氯特羅、苯氧丙酚胺等）極易被不法分子利用，作為新型“瘦肉精”替代物，用于生豬養殖過程中，達到非法牟利的目的，進而威脅廣大消費者的健康安全。

尿液常被選擇作為藥物代謝、殘留消除實驗的重要靶組織，而且，與其它組織樣品相比，尿液在樣品采集過程中可有效避免對動物造成損傷，因此，動物尿液通常作為大批量樣品監測的測試對象[3]。近年來，研究者針對動物尿液中β.受體激動劑藥物殘留建立了包括液相色譜[4]、氣相色譜.串聯質譜[5]、液相色譜.串聯質譜[3，6～11]、ELISA[12]、膠體金試紙法[13]、免疫傳感器[14]、液相芯片法[15]等一系列快速檢測及定量確證檢測方法。而賽庚啶、可樂定作為新型“瘦肉精”藥物，分別屬于H1受體拮抗藥和α2.受體激動劑[14，15]，其化學結構與β.受體激動劑藥物有較大的差異（各藥物的化學結構見圖1），理化特性、色譜行為也有較大差別，因而同時檢測賽庚啶、可樂定與β.受體激動劑的方法鮮有報道[16]。

本研究建立了超高效液相色譜.串聯質譜快速、簡單地同時測定豬尿液中30種不同種類“瘦肉精”藥物（賽庚啶、可樂定及28種β.受體激動劑類）殘留的方法，為加強生豬養殖、屠宰過程中違法使用不同種類“瘦肉精”的監管提供了可靠的技術支撐。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

AcquityTM UPLC.Xevo TQ MS超高效液相色譜.串聯質譜儀（配電噴霧離子源）、UPLC CSH C 18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH Shield RP 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、固相萃取裝置、Oasis MCX固相萃取柱（60 mg， 3 mL）均為美國Waters公司產品； 5804R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）； 氮吹儀（美國Organomation公司）。

標準品： 鹽酸克侖特羅（Clenbuterol hydrochloride， 98.5%）、鹽酸溴布特羅（Brombuterol hydrochloride， 98.5%）、鹽酸班布特羅（Bambuterol hydrochloride， 98.0%）、萊克多巴胺（Ractopamine， 97.0%）、沙丁胺醇（Salbutamol， 100%）、鹽酸克倫潘特（Clenpenterol hydrochloride， 99.5%）、羥甲基克倫特羅（Hydroxy.methyl clenbuterol， 99.0%）、克倫丙羅（Clenproperol， 99.0%）、特布他林（Terbutaline， 985%）、非諾特羅（Fenoterol， 100 mg/L， 溶于乙腈）購自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司； 苯乙醇胺A（Phenylethanolamine A， 98.0%）、鹽酸馬布特羅（Mabuterol hydrochloride， 99.0%）、齊帕特羅（Zilpaterol， 98.0%）、卡布特羅半硫酸鹽（Carbuterol Hemisulfate Salt， 98.0%）、硫酸丁酚胺（Bamethane sulfate， 98.0%）、苯氧丙酚胺（Isoxsuprine， 98.0%）購自Toronto Research chemicals INC公司； 鹽酸利托君（Ritodrine， 98.0%）購自Tokyo Chemical Industry公司； 鹽酸可樂定（Clonidine hydrochloride）、鹽酸賽庚啶（Cyproheptadine hydrochloride）購自European Pharmacopoeia公司； 氯丙那林（Clorprenaline， 99.0%）、西布特羅（Cimbuterol， 99.0%）、西馬特羅（Cimaterol， 99.0%）、妥布特羅（Tulobuterol， 99.0%）、克倫己羅（Clenhexerol， 99.6%）、鹽酸克倫塞羅（Clencyclohexerol hydrochloride， 99.0%）、鹽酸異克倫潘特（Clenisopenterol hydrochloride， 99.7%）、鹽酸馬噴特羅（Mapenterol hydrochloride， 99.0%）、鹽酸溴氯特羅（Bromchlorbuterol hydrochloride， 99.0%）、鹽酸噴布特羅（Penbutolol hydrochloride， 99.0%）購自Witega Laboratorien BerlinAdlershof GmbH公司； 酒石酸福莫特羅 （Formoterol tartrate， 98.0%）購自美國International Laboratory 公司。

2.2 標準溶液配制

分別準確稱取各標準品（10.00±0.10）mg， 以甲醇溶解并定容至10 mL， 即為各標準物質儲備液。分別量取適量的30種藥物儲備液于另一潔凈10 mL容量瓶中混合，配制100 μg/L混合標準工作液， 20℃保存備用。

2.3 樣品前處理

準確量取尿液5.00 mL于50 mL具塞離心管中，5000 r/min離心5 min，將上清液用5%乙酸溶液調至pH 3.0后，加入經3 mL甲醇、3 mL水活化的MCX柱，分別用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，真空泵抽干后以3 mL 5%氨化甲醇洗脫，45℃水浴條件下N2吹近干，用1 mL 0.1%甲酸.乙腈（9∶1， V/V）溶液復溶，UPLC.MS/MS檢測。

2.4 色譜.質譜條件

色譜條件： 流動相A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈，液相洗脫梯度程序： 0～1.0 min，95% A； 1.0～3.0 min，95%～87% A； 3.0～4.0 min，87%～60% A； 4.0～5.0 min，60%～10% A； 5.0～5.1 min，10%～95% A； 5.1～7.0 min，95% A。進樣量： 5 μL，柱溫： 35℃，流速： 0.3 mL/min。

質譜條件： 電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應監測（MRM）模式。毛細管電壓2700 V，離子源溫度150℃，霧化室溫度450℃，去溶劑氣（氮氣）流量： 1000 L/h； 錐孔氣（氮氣）流量： 50 L/h； 碰撞氣（氬氣）流量： 0.24 L/h。

3 結果與討論

3.1 質譜參數的確定

選擇一定濃度的標準溶液，利用Intelstart軟件，以ESI正離子模式對待測藥物進行母離子確認及子離子全掃描。確定以[M+H]+作為各藥物的分子離子，分別對儀器的錐孔電壓、碰撞能量等參數進行優化，進行子離子掃描，選取2個豐度強、穩定的碎片離子作為定性與定量離子，以滿足歐盟2002/657/EC[17]對于禁用藥物LC.MS/MS方法的定性監測的規定，即滿足1個母離子、2個子離子共4個鑒定點數的要求。因此，本方法根據待測藥物的保留時間，采用分段掃描的方式對不同藥物的特征離子進行數據采集，以提高靈敏度。30種藥物的保留時間及定性、定量離子等參數見表1。

3.2 色譜條件的優化

由于28種β.受體激動劑藥物具有較為相似的化學結構及相近的色譜保留特性，而可樂定和賽庚啶與β.受體激動劑藥物化學性質、色譜行為差異較大[16]，為了將上述藥物在盡可能短的時間內有效分離，本實驗分別考察了BEH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、CSH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH Shield RP 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）4種型號的色譜柱對30種目標化合物的分離效果。結果表明，HSS T3色譜柱對目標化合物的保留能力較弱，尤其是沙丁胺醇、西馬特羅、特布他林等12種極性較強的藥物，即使用含量低于5% 的乙腈進行淋洗，其保留時間均小于1.0 min， 且不能有效分離。其余3種色譜柱均能有效保留30種藥物，而采用CSH C 18色譜柱較BEH C 18和Shield RP 18色譜柱，可有效分離上述藥物，且各化合物峰形尖銳。圖2為30種典型的瘦肉精的空白和加標樣品色譜圖。

為了更好地將待測物有效分離，降低共流出物基質干擾，本實驗還考察了甲醇、乙腈分別與水、0.1%甲酸及含 50 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸溶液等作為流動相，對目標化合物的峰形、分離度、靈敏度等的影響。結果表明，流動相中添加甲酸后，待測物的信號強度明顯提高，且藥物保留時間有所提前； 而以50 mmol/L甲酸銨.0.1%甲酸溶液作為流動相時，待測物的信號強度、分離度等與0.1%甲酸溶液無顯著差異。甲醇和乙腈作為流動相對信號強度的影響不顯著，而甲醇作為流動相進行梯度洗脫時，色譜柱壓差變化范圍較大，平衡時間延長。因此，本實驗采用UPLC CSH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）作為分析柱，以乙腈.0.1%甲酸作為流動相進行梯度洗脫。30種“瘦肉精”藥物可在5.0 min內實現良好分離，各藥物的定量離子的提取離子色譜圖如圖2所示。

3.3 樣品前處理條件的優化

本方法采用將尿液簡單離心，直接用MCX固相萃取柱凈化的樣品前處理方法。為了充分確保本方法的可靠性，本實驗考察了文獻[5，19～21]所采用的樣品前處理方法（需酶解、液液萃取和/或固相萃取等步驟），分別采用叔丁醇.叔丁基甲醚[19]、乙酸乙酯/異丙醇[5，20]、HClO4[20，21]等試劑對豬尿樣品中待測藥物的提取，對各操作方法的提取操作步驟、所需的主要化學試劑及數量、方法的回收率、精確度等技術參數進行比較。檢測結果表明，本方法不僅可獲得較為滿意的方法準確度、精確度（如表2所示，本實驗采用尿液經離心后直接凈化，30種藥物的回收率在67.6%～103.2%，相對標準偏差為2.8%～16.8%），滿足藥物殘留定量確證檢測的要求，而且操作步驟簡單、快速，試劑使用量少，不需要復雜的樣品前處理步驟，平均每個樣品的提取、凈化過程僅使用很少量的有機溶劑（約7 mL甲醇），較文獻[5，19～21]大大減少了有機溶劑的使用量，尤其是高氯酸等鹵素試劑的使用量。本方法可作為環境友好型的樣品前處理方法，適用于豬尿液樣品中不同種類“瘦肉精”多殘留大批量樣品的篩選及確證檢測。

3.4 方法學考察

3.4.1 基質添加標準曲線、線性范圍、相關系數、檢出限和定量限 在上述最佳色譜.質譜條件下，將空白豬尿樣品按照2.3節進行樣品處理，在洗脫液中加入一系列30種藥物混合標準溶液（0.1， 0.3， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0和10.0 μg/L），LC.MS/MS進行檢測，以各組分的濃度與其定量離子峰面積進行線性回歸，呈良好的線性關系（r2>0.992）。以3倍信噪比（S/N）計算，本方法測定豬尿液中30種“瘦肉精”藥物的檢出限為0.1 μg/L； 以l0倍信噪比（S/N）計算，定量限為0.3 μg/L。

3.4.2 準確度和精密度 本實驗，分別在豬尿液中以3個濃度水平（0.3， 0.6和3.0 μg/L）進行空白樣品加標回收實驗，考察方法的回收率、日內變異系數和日間變異系數，以基質添加標準曲線進行校正，結果如表2所示。30種“瘦肉精”藥物的平均回收率在67.6%～103.2%之間，日內、日間相對標準偏差分別為2.8%～16.8%和2.6%～15.8%。

3.5 實際樣品的檢測

運用本方法對浙江省某生豬屠宰場隨機抽取的100份豬尿液進行測定，與農業部1025號公告.11.2008[5]和農業部1063號公告.3.2008[19]兩個標準方法的測定結果基本一致，有1份樣品檢出萊克多巴胺殘留，其余樣品均未檢出“瘦肉精”藥物殘留。利用本方法及兩個行業標準測定的檢出值分別為6.58、7.03和6.46 μg/L，變異系數小于4.5%； 而本方法卻極大地節省了檢測時間， 有機溶劑使用較少， 說明本方法簡單快速、靈敏、可靠。

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篇9

關鍵詞：苯唑西林鈉；反相高效液相色譜法；物質；測定；檢測

苯唑西林鈉是青霉素抗生素類的一種常見藥物，不僅用于口服，目前很多臨床診療中都將這類藥物作為肌肉注射藥物，主要用于治療輕度感染方面。但如果采用靜脈注射還是靜脈滴注，那說明患者的感染比較嚴重，是用于葡萄球菌等抗生菌藥物的常見方式。近年來，隨著人們健康醫療醫師的不斷提升，對于各類藥物的使用安全提出了新要求，由此做好這些藥物相關物質檢定工作不容忽視，也是臨床診療工作重點所在。下面我們就反相高效液相色譜法在苯唑西林鈉中的具體檢測應用情況作了深入分析。

1 儀器與藥物的選擇

1.1 儀器選擇

在本次試驗中所選擇的高效液相色譜儀主要是以美國某公司生產的，它包含了四元梯度泵、自動進樣器等。電子天平主要選擇了梅特勒240型號，其靈敏度最高達十萬分之一。

1.2 藥物的選擇

本次試驗中，苯唑西林鈉的選擇是嚴格按照其藥物性質開展的，這類藥物作為耐酸耐酶的半合成青霉素藥物，具體療效與青霉素相差無幾，屬于細菌細胞蛋白結合藥物，主要在于影響細胞細胞壁的合成，從而達到殺菌、消毒、消炎的作用。目前，我國國內生產的苯唑西林鈉普遍都為無菌分裝、無輔料的方式。但是時至今日，國內對這些藥物的檢定標準并不都，各種鑒定結果還并不是很完善。在本次試驗中我們選擇的苯唑西林鈉為注射用藥，藥物規格為：0.5g?瓶-1，乙腈和醋酸銨都滿足國家生產標準和用藥標準。水主要為純凈水（即蒸餾水）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜條件的預備工作主要包含了對色譜柱、醋酸銨溶液、流動相等準備工作的開展。色譜柱主要為C18，其內部物質為250mm×46mm.醋酸銨溶液在配備的時候酸堿值為5，與乙腈的比例為75：25；流動相為0.01mol?min-1。

2.2 檢測波長的選擇

此次實驗工作的目標在于注射用苯唑西林鈉，因此在檢測的時候首先用電子天平城區一定量的苯唑西林鈉含量，并且用流動相溶解的方法將其制作成為含1mg?ml-1的苯唑西林鈉溶液，用二極管陣列檢測的方式對這些溶液中的含量進行檢測，通過掃描得出溶液匯總的波長為400～200nm。通過研究得出，這些波長在225nm的時候吸收能力最強，雜質也比較少。因此在具體的研究中我們可以將225nm波長作為研究重點，具體如圖1所示。

2.3 色譜條件的選擇與優化

2.3.1 溶液的制備。稱取注射用苯唑西林鈉25.16mg，置25mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度。

2.3.2 流動相pH值的確定。用醋酸和三乙胺調節不同pH值的流動相進行試驗，結果表明在pH值為5.0時，峰的對稱性最好。

2.3.3 緩沖鹽濃度的確定。配制不同濃度的醋酸銨溶液作為流動相水相進行試驗，結果表明在濃度為0.01mol?L-1時，雜質的分離度與對稱性最好。

2.4 方法的專屬性考察

2.4.1 酸破壞。稱取注射用苯唑西林鈉約25mg，置于25mL量瓶中，加1mol?L-1鹽酸10mL溶解后，放置1h，調節pH值至7.0，再加流動相稀釋至刻度。

2.4.2 堿破壞。稱取注射用苯唑西林鈉約25mg，置于25mL量瓶中，加0.05mol?L-1氫氧化鈉溶液2mL溶解后，放置3min，調節pH值至7.0，再加流動相稀釋至刻度。

2.4.3 氧化破壞。稱取注射用苯唑西林鈉約25mg，置于25mL量瓶中，加3%過氧化氫2mL溶解后，放置2h，調節pH值至7.0，再加流動相稀釋至刻度。

2.4.4 熱破壞。稱取注射用苯唑西林鈉約25mg，置于25mL量瓶中，用流動相溶解稀釋至刻度，70℃水浴中加熱2h，放冷至室溫。

2.4.5 光照破壞。稱取注射用苯唑西林鈉約25mg，置于25mL量瓶中，用流動相溶解稀釋至刻度，用3000～4000Lx光照射10d。具體結果間圖2所示。

2.5 線性關系

精密稱取注射用苯唑西林鈉58.57mg置50mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取2.5mL置100mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取1、2、4、6、10、12和24mL各置25mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件分別精密量取10μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以供試液濃度C（μg?mL-1）為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸，回歸方程為：A=5.238×104C+4.182×103，r=0.9998，表明苯唑西林鈉濃度在1.171～28.11μg?mL-1與峰面積呈良好的線性關系。

3 討論

中國藥典2010年版二部收載了本品的質量標準，有關物質的檢驗方法和限度設定系完全參照BP2008制定，采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，并采用相對保留時間對其中的特殊雜質進行定位[雜質B≤1.5%、雜質D≤0.5%、雜質E（即氯唑西林）≤1.0%、其他單個雜質≤0.5%，總雜質≤3.0%]。經對該方法進行方法學考察，發現采用相對保留時間對特殊雜質定位的誤差較大，且色譜系統的耐用性不好，部分色譜柱的分離度無法達到要求或完全無法分離。本文采用的HPLC色譜條件能將各雜質進行有效分離，且實驗中選擇醋酸銨溶液作為流動相的水相，便于將質譜儀串聯于PDA檢測器之后，流出液可直接進入質譜儀，利于后續研究的進行。選擇醋酸銨溶液濃度為0.01mol?L-1，峰形對稱，柱效高，基線平穩。

結束語

在酸、堿、氧化破壞試驗中表明，本品易受這些條件的影響，光照與溫度也易影響本品的質量，故應注意本品的儲藏條件和使用的期限。

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篇10

關鍵詞：1，4二氯苯；吹掃捕集；氣相色譜；毛細管柱；1，4二氯苯

中圖分類號：TG4 文獻標識碼：A 文章編號：1009-2374（2013）06-0050-02

1，4二氯苯廣泛用于工業用和家用產品，如氣味掩蓋劑、染料和殺蟲劑，有資料顯示DCB短期接觸后會對人體造成急性溶血性貧血、腎小球腎炎，長期接觸1，4二氯苯會引起網狀內皮系統紊亂、中樞神經受影響和肝損傷。1，4二氯苯是《生活飲用水衛生標準》（GB5749-2006）要求檢測的有機物指標，規定在飲用水中的含量不得超過0.3mg/L。GB5749-2006中采用填充柱進行分離，由于填充柱分離度、靈敏度不高，使用效率較低。吹掃捕集技術具有濃縮倍數高、可測定范圍寬、無溶劑污染等優點，是測定水中揮發性有機物的有效方法，為此建立毛細管柱氣相色譜法測定水中1，4二氯苯，其分離度好，采用吹掃捕集進樣，預處理簡單快速，靈敏度高。

1 試驗儀器與試劑

1.1 試驗儀器

安捷倫7890氣相色譜儀，ECD檢測器，毛細管柱使用19091J-413毛細管柱（30m×0.32mm×0.25um），

色譜柱使用HP-5型；吹掃捕集進樣器使用美國

TELEDYNE TEKMAR（型號），5mL注射器。

1.2 試驗試劑

標準溶液：購自百靈威公司（J&K）1，4二氯苯濃度為100mg/L。

甲醇：色譜純。

純水：無揮發性有機物（VOCS）超純水。

2 試驗方法

2.1 樣品進樣處理

采用直接進樣方式，進樣時用5mL注射器于待測水樣中抽吸幾次，排出氣泡后迅速注入吹掃捕集進樣器中，按預先設置好的條件進行分析。

2.2 標準曲線的制備

將濃度為100mg/L的1，4二氯苯標準溶液用甲醇配置成1mg/L的1，4二氯苯儲備溶液，然后用純水配置成100μg/L的1，4二氯苯標準使用溶液，再取4個100mL的容量瓶，分別取1mL、2mL、5mL、10mL的100μg/L的1，4二氯苯標準使用溶液，用超純水配置成濃度為0.001mg/L、0.002mg/L、0.005mg/L、0.010mg/L的1，4二氯苯標準系列，按2.3的條件測定。

2.3 儀器條件

2.3.1 檢測器：以ECD為檢測器。

2.3.2 色譜條件：色譜柱采用非極性常用柱19091J-413；升溫程序：40℃保持1min，以5℃每分鐘速率升至80℃，以10℃每分鐘速率升至150℃保持1min。

進樣方式：分流進樣，分流比5：1；進樣口溫度：210℃；檢測器溫度：250℃；載氣流量（高純氮）：柱流速1.5mL/min。

3 結果與分析

3.1 標準曲線及檢出限

1，4二氯苯濃度作為X軸，峰面積為Y軸，做標準曲線，如圖1所示，擬合得到標準曲線方程為Y=725.19X+86.20，相關系數R=0.9995。1，4二氯苯標準曲線中各濃度測定的響應值（峰面積）見表1，1，4二氯苯標準色譜見圖2。

由表3可知，該實驗加標回收率良好，加標回收率在97.33%～98.87%之間，平均回收率為98.26%，符合75%～105%范圍。

4 結語

采用吹掃捕集毛細管柱氣相色譜法測定水中的1，4二氯苯，操作簡便，測定結果穩定、準確。該方法實驗的標準曲線方程相關系數R=0.9995，線性良好；相對標準偏差（RSD）為2.70%，小于5%；加標回收率在97.33%～98.87%之間，平均回收率為98.26%，符合75%～105%范圍，精密度和加標回收率良好，對于檢測自來水和地表水中的1，4二氯苯具有很好的實用價值。

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