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【關鍵詞】水孔蛋白

Expressionanddistributionofaquaporin4inspinalcordofNewZealandrabbits

【Abstract】AIM:Toexaminetheexpressionanddistributionofaquaporin4(AQP4)innormalspinalcordofrabbits,soastoprovidetheoreticalbasisfortheroleofAQP4inspinalwatertransportandbalanceregulation.METHODS:ImmunohistochemistryandinsituhybridizationwereperformedonspinalparaffinsectionsfromhealthyadultrabbitstodetecttheexpressionanddistributionofAQP4proteinandmRNA.RESULTS:Thepositivecellsmostlyincludedependymalcellsofmyelocoele,glialcells,anteriorhornmotorneurons,andepithelialcellsofspinalpiamaterandtheirexpressionsweremainlylocatedoncellmembrane.Interestingly,AQP4distributioninglialcellsandependymalcellsshowedcertaindirectivity,buttheformerwasmainlyinthemembranesidecontactingwithcapillaryendothelialcellsandthelattermostlyinthebasolateralmembraneofependymalcells.CONCLUSION:AQP4iswidelyexpressedinrabbitspinalcordanditsanatomicallocationssuggesttheAQP4maybeinvolvedinspinalcordwatertransportandbalanceregulationandelectrolytemetabolism,evencanbelocallyregulatedtomeetspecialfunctionalrequest.

【Keywords】aquaporin4;rabbitss;spinalcord;immunohistochemistry;insituhybridization

【摘要】目的：探討正常新西蘭大白兔脊髓水通道蛋白4(AQP4)的定位與表達，為研究其在脊髓水代謝中的作用提供理論基礎.方法：選用正常成年新西蘭大白兔，采用免疫組化和原位雜交技術檢測脊髓AQP4蛋白及其mRNA的定位及表達.結果：免疫組織化學染色和原位雜交結果顯示膠質細胞、前角運動神經元、中央管室管膜細胞、軟脊膜上皮細胞均表達陽性，AQP4主要分布于細胞膜，其中，膠質細胞和中央管室管膜細胞表達存在極性，前者主要分布在與毛細血管內皮細胞接觸的一側，后者主要分布在中央管室管膜細胞的基底側膜.結論：AQP4在正常兔脊髓內具有廣泛的表達，其表達的解剖定位提示AQP4在脊髓內主要參與水分子的轉運及平衡調節、電解質代謝，并受局部調節以適應特殊的功能需求.

【關鍵詞】水孔蛋白4；兔；脊髓；免疫組織化學；原位雜交

0引言

水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一種疏水性膜蛋白家族，自1988年第一個AQP被發現［1］并于1997年正式命名為AQP1以來，目前已經發現11種之多.AQP廣泛存在于動、植物的細胞膜上，介導調節水分子的跨膜轉運［2-3］.其中，AQP4在中樞神經系統表達最為豐富，研究證實其在腦內主要分布于星形膠質細胞、軟腦膜、室管膜、脈絡叢以及下丘腦的視上核和室旁核等部位，參與了水分子的轉運及平衡調節（如腦脊液的生成、重吸收）、電解質代謝和內分泌活動［4］.但有關AQP4在脊髓的定位、表達和功能的研究有限，特別是在正常新西蘭大白兔脊髓的分布少見報道.為此，我們應用免疫組化和原位雜交技術研究AQP4在新西蘭大白兔脊髓的定位，推測其可能的生理功能，并為AQP4在脊髓病態的表達提供有益的對比資料.

1材料和方法

1.1材料成年健康新西蘭大白兔6只(河北醫科大學實驗動物中心)，雌雄各3只，體質量1.5～2.0kg.一抗為鼠抗AQP4多克隆抗體（1∶200,Sigma公司）.SABC免疫組化試劑盒(北京中山金橋生物技術有限公司).AQP4原位雜交檢測試劑盒(武漢博士德公司).

1.2方法

1.2.1標本的制備在氯胺酮過度麻醉下剪開動物胸腔，經心臟灌注生理鹽水500mL至流出液清亮后給予灌注40g/L多聚甲醛PBS緩沖液(pH7.3)500mL.先快后慢，灌注固定后經后正中切口、咬除棘突和椎弓根，取頸、胸、腰段脊髓各2小段，其中各脊髓節段1小段置入相同固定液中后固定24h用于免疫組化，剩余各脊髓節段置入相同固定液中后固定2h用于原位雜交.后固定成功后用蒸餾水清洗12h，逐級梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、4μm切片并裱于經10g/L多聚賴氨酸處理的清潔載玻片，用于免疫組織化學和原位雜交檢測.

1.2.2免疫組織化學檢測按免疫組織化學常規步驟進行.切片于新鮮配制的30mL/LH2O2室溫浸泡10min以滅活內源性過氧化物酶；滴加正常山羊血清30min；滴加一抗抗人AQP4，37℃恒溫孵育2h,PBS洗；滴加二抗生物素化羊抗兔IgG室溫下30min，滴加試劑SABC，室溫30min；DAB顯色，室溫20min；脫水、透明，中性樹膠封片.染色對照：同一組片中分別用正常山羊血清和PBS代替AQP4一抗作孵育，其余步驟同上.

1.2.3AQP4mRNA原位雜交按原位雜交檢測試劑盒說明書進行.切片用40mL/L多聚甲醛(內含1mL/LDEPC)固定30min后入3mL/LPBSH2O230min以除去內源性過氧化物酶活性；然后胃蛋白酶37℃消化5min,40mL/L多聚甲醛終止反應5min；每張切片滴加含2mg/LAQP4mRNA地高辛標記探針的原位雜交液30μL，置濕盒中42℃雜交20h；分別用37℃預熱的2×SSS，0.1×SSS洗滌5min×3,10min×2；滴加小鼠抗地高辛抗體37℃2h,0.5mol/LTBS洗滌5min×3；滴加生物素化羊抗小鼠IgG37℃1h,0.5mol/LTBS洗滌5min×3；滴加ABS37℃30min.DAB顯色，脫水，透明，中性樹膠封片.陰性對照：分別用不含探針的雜交緩沖液取代含探針的雜交液及用正常羊血清取代羊抗地高辛抗體IgG進行孵育.

2結果

2.1免疫組化檢測在脊髓灰質，AQP4陽性著色看起來彌散于整個神經氈，只有神經元胞質不著色，細胞輪廓清楚（圖1）.著色濃度最深的是位于后角的第I，Ⅱ板層，自背側向腹側存在著濃度梯度遞減的變化趨勢，到了中間帶和前角AQP4著色中等，但后角頸部的內層部分（第Ⅳ板層），中央管周圍區域（第X板層）和胸段的中間外側柱著色仍深.在白質，AQP4免疫陽性著色集中在起自灰質并向脊髓表面放射的纖維膠質突起上（圖2），主要是星形膠質細胞的突起表達濃郁，或定向放射，或沿脊髓的外界和圍繞血管形成膠質膜.脊髓軟脊膜上也呈陽性表達.AQP4的分布除了較少差別外，在所有脊髓節段中均具有可比性并且呈粗略的線形分布.脊髓AQP4的陽性表達主要位于膠質細胞、神經元的細胞膜上：灰質內的星形膠質細胞有強陽性著色，以細胞膜著色為主，脊髓前角運動神經元胞膜也有陽性著色（圖3A）.中央管室管膜上皮細胞呈陽性表達，以靠細胞膜基底側較明顯，部分室管膜細胞呈較深的整個胞膜著色（圖3B）.脊髓白質內的纖維性星形膠質細胞、脊髓表面軟脊膜上皮細胞的細胞膜也呈強陽性表達，以鄰近蛛網膜下腔和面向毛細血管內皮細胞的膠質細胞表現得尤為突出（圖3C）.膠質細胞和中央管室管膜上皮細胞著色具有一定的極性分布，前者主要分布于與毛細血管接觸的一端，后者主要分布在靠近基底側處.上述分布現象在脊髓不同節段無明顯差異.

圖1新西蘭兔頸髓AQP4的表達SABC×16（略）

圖2新西蘭兔脊髓白質側素AQP4的陽性表達SABC×400（略）

2.2AQP4mRNA原位雜交檢測AQP4mRNA在脊髓神經元和膠質細胞均有表達.在灰質內，神經元、膠質細胞胞質內均有不同程度深色的棕色或棕褐色顆粒，未檢測到胞核中有雜交信號（圖4A）.其中，中央管室管膜細胞和位于后角的膠質細胞均呈強陽性表達（圖4B）.白質內膠質細胞也呈強陽性表達（圖4C）.

A：頸髓灰質前角;B:脊髓中央管室膜細胞;C:脊髓側索中圍繞血管的星形膠質細胞終足.

圖3新西蘭兔AQP4的表達SABC×400（略）

A：脊髓前角灰質;B：脊髓后角灰質;C:脊髓白質側索.

圖4新西蘭免AQP4mRNA的陽性表達DAB×200（略）

3討論

由于脊髓生理功能的重要性，許多學者對AQP4在其中的分布進行了研究，盡管發現AQP4在脊髓的表達分布于灰質和鄰近脊髓血管上皮細胞的膠質細胞的突起，但具體的神經解剖定位未見報道［5-6］.我們應用免疫組化及原位雜交技術發現，AQP4在整個脊髓均有表達，包括神經元和膠質細胞，主要為細胞膜著色，特別是鄰近蛛網膜下腔和面向毛細血管內皮細胞的膠質細胞表現得尤為突出.根據形態學觀察，灰質中AQP4表達陽性的膠質細胞可能是原漿性星形細胞，白質中者為纖維性星形膠質細胞.灰質AQP4密集著色大部分也源于其在圍繞毛細血管的星形膠質細胞足突的著色，并被免疫膠體金技術所證實［7］，有人認為其參與形成血腦屏障［8］.Solenov等［9］證實了AQP4敲除小鼠脊髓后角深層的滲透膨脹比率明顯降低，而急性脊髓損傷水腫以灰質最為突出，也就是說，AQP4的表達模式與脊髓水腫定位一致.表明AQP4在脊髓的水平衡中發揮了重要作用.

我們發現，AQP4表達的一個特點是位于脊髓組織－液體接觸的部位：即中央管室管膜上皮細胞和沿軟膜排列的膠質細胞AQP4表達豐富，室管膜細胞的陽性著色主要位于基底側膜，這一發現與Rash等［10］所描述的大鼠脊髓室管膜免疫膠體金AQP4標記一致.與其他上皮組織不同，室管膜細胞沒有基底膜，取而代之的為其下膠質細胞的膠質膜形成基底側膜.同樣的解剖結構也存在脊髓表面的軟膜和神經膠質膜之間的連接.這些解剖特點提示AQP4在調節脊髓及其周圍腦脊液之間水的轉運可能起重要作用.我們還發現，分布于面向毛細血管內皮細胞和軟脊膜側膠質細胞和前角運動神經元細胞膜上的AQP4在組織解剖分布上與K+通道相一致，Walz［11］和Nagelhus等［12］的研究資料也證實了相同極性分布現象.當神經細胞受到刺激產生動作電位時，細胞外間隙K+濃度將升高，升高的K+將被主要集中在膠質細胞的足突膜上K+通道所分流，但K+的流動必將伴隨水分子的流動，以代償因K+流動所引起的滲透壓的變化.由此推測，AQP4可能在功能上參與調節細胞外K+，水的代謝.

AQP4表達的另一個突出特點是脊髓灰質呈明顯的板層差異性分布：后角最淺表的I，II板層表達最為強烈，而中間帶灰質較弱，前角中等.這種板層分布的差異性并不能單純為星形細胞密度所解釋.例如，新皮層和海馬觀察到AQP4強度相當，但后者星形細胞密度較高.可能原因有：①脊髓后角的I,II板層中的神經元主要為中、小型細胞，胞體不足神經元胞體的6%，其余為大量的樹突叢與膠質細胞及其樹突叢，它們之間形成廣泛、密集的突觸聯系，AQP4著色也就最為強烈；②后角接受谷氨酸能神經纖維的傳入，谷氨酸是傷害性和非傷害性初級傳入纖維、后角中間神經元的神經遞質，這些神經纖維平時就進行著大量較強而復雜的神經電活動，局部細胞內外電解質、水分子轉運活動頻繁，AQP4的需要量較大.即脊髓的板層樣AQP4表達可能受局部調節以適應特殊的功能需求.總之，我們的研究提示，AQP4參與了脊髓水分子轉運及平衡調節、電解質代謝，并且其表達受局部調節以適應特殊的功能需求，但具體調節機制還需進一步研究.

【參考文獻】

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