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【摘要】本研究探討78例非霍奇金淋巴瘤BCL-XL表達和突變的發生率及其臨床意義。應用激光微切割技術從淋巴結組織中特異地分離淋巴瘤細胞，用實時定量RT-PCR法檢測淋巴瘤組織和淋巴瘤細胞中BCL-XL的表達，PCR直接測序法檢測BCL-XL的突變情況。結果表明：與淋巴結反應性增生（15例）相比，濾泡性淋巴瘤（30例）組織和微切割的淋巴瘤細胞均高表達BCL-XL（P值分別為0.0064和<0.0001），而T細胞淋巴瘤（24例）和彌漫性大B細胞淋巴瘤（24例）中BCL-XL表達無明顯升高。在濾泡性淋巴瘤中，BCL-XL高表達的患者常伴多個淋巴結外器官累及（P=0.0004），血清乳酸脫氫酶水平升高（P=0.0019），國際預后指數分組多為高危組（P=0.0013），患者總生存期短（P=0.0451）。突變檢測發現1例濾泡性淋巴瘤BCL-XL的同義突變（密碼子109ACA→ACC）。結論：BCL-XL表達與濾泡性淋巴瘤的疾病進展和患者預后密切相關。

【關鍵詞】非霍奇金淋巴瘤；BCL-XL基因；基因表達；基因突變

BCL-XLExpressionandMutationinNon-Hodgkin′sLymphoma

AbstractThestudywasaimedtoinvestigatetheBCL-XLexpressionandmutation,anditsclinicalsignificanceinnon-Hodgkin′slymphoma.Lymphomacellswereselectivelyisolatedbylasermicrodissection.BCL-XLexpressionfromlymphomatissueandmicrodissectedlymphomacellswasmeasuredbyusingreal-timequantitativereversetranscription-polymerasechainreaction.BCL-XLmutationwasanalyzedbyusingdirectsequencingofPCRproducts.Theresultsshowedthatcomparedto15patientswithreactivehyperplasia,BCL-XLwasoverexpressedinfollicularlymphoma(n=30),bothinlymphomatissue(P=0.0064)andinmicrodissectedlymphomacells(P<0.0001).NosignificantriseofBCL-XLexpressionwasobservedinpatientswithT-celllymphoma(n=24)anddiffuselargeBcelllymphoma(n=24).Infollicularlymphoma,highBCL-XLlevelwasassociatedwithmultipleextranodalinvolvement(P=0.0004),elevatedlactatedehydrogenaselevel(P=0.0019),high-riskinternationalprognosticindex(P=0.0013)andashortoverallsurvivaltime(P=0.0451).Mutationanalysisrevealedonesynonymousmutation(Codon109ACA→ACC)inonecaseoffollicularlymphomapatient.ItisconcludedthatBCL-XLexpressioniscloselycorrelatedwithprogressoffollicularlymphomaandprognosisofpatientswithfollicularlymphoma.ThevalueofBCL-XLexpressionasaprognosticmarkerinfollicularlymphomashouldbeconsidered.

KeywordsNon-Hodgkin′slymphoma;BCL-XLgene;geneexpression;genemutation

淋巴瘤是一種起源于淋巴組織的惡性腫瘤，分為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。近20年來，非霍奇金淋巴瘤在世界范圍內的發病率幾乎增長了1倍，嚴重危害人類的健康［1］。因而探索淋巴瘤的發病機制、掌握淋巴瘤的疾病進展相關基因，對于淋巴瘤的診斷治療前景，特別是開展個體化診治和基因靶向治療具有重要意義。

凋亡異常對于惡性腫瘤的發生發展起著相當關鍵的作用。凋亡受阻致使腫瘤細胞壽命延長，異常堆積，最終引起細胞轉化和腫瘤形成［2］。同時，誘導凋亡又是腫瘤治療，包括化療藥物治療、放射治療和免疫治療的重要機制之一。凋亡抑制可使腫瘤細胞產生耐藥，導致治療失敗或疾病復發［3］。細胞凋亡主要通過兩個途徑：外源性途徑和內源性途徑。后者起始于線粒體細胞色素C的釋放，作用于凋亡蛋白酶激活因子（apoptoticprotease-activatingfactor-1，Apaf-1），誘導caspase-9活化，導致細胞凋亡［2］。BCL-2家族在調節凋亡的內源性途徑中起著重要作用，按其功能不同主要分為兩類：一類是促凋亡蛋白，包括BAX、BAK、BOK、BCL-XS、BID、BAD等，另一類是抗凋亡蛋白，包括BCL-2、BCL-XL、BCL-W、MCL-1、A1等［4］。在非霍奇金淋巴瘤中，內源性途徑受抑也是影響腫瘤細胞凋亡的重要因素［5］。BCL-XL是BCL-2家族的主要凋亡抑制因子，由BCL-X編碼，后者位于20q11.21，由3個外顯子組成。BCL-X缺陷的小鼠表現為幼稚淋巴細胞的凋亡明顯增加，同時亦證實BCL-XL在淋巴瘤中表達［6，7］。然而，它在不同類型淋巴瘤中的表達情況和與疾病進展的關系尚缺乏系統的研究。本研究應用實時定量RT-PCR法檢測78例患者淋巴瘤組織和細胞中BCL-XL的表達，應用PCR直接測序法檢測是否存在BCL-XL突變，探討BCL-XL的表達及基因突變在淋巴瘤發生發展中的意義。

材料和方法

患者

患者共78例,來自上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院和法國巴黎第七大學圣路易醫院，其中男38例，女40例，年齡21-88歲，中位年齡52歲。按WHO病理分型，78例中T細胞淋巴瘤24例，彌漫性大B細胞淋巴瘤24例，濾泡性淋巴瘤30例。對照組為淋巴結反應性增生患者，共15例。兩組均經患者知情同意后，留取部分淋巴結活檢組織，-80℃凍存，用于提取DNA和RNA。另有60例健康志愿者，采集其外周血，提取DNA，作為基因突變檢測對照。

激光微切割

用淋巴結冷凍組織制備7μm切片，70%酒精固定，蘇木素-伊紅染色。應用激光微切割儀（LEICA公司產品）切割約1500個淋巴瘤細胞，自動置入TRIzoL中，用于RNA提取。

DNA提取

按常規酚-氯仿抽提，冷無水乙醇沉淀法提取基因組DNA［8］，最后溶于適量TE中。紫外分光光度計測定樣品DNA含量。

RNA提取

淋巴結組織總RNA經制備10-15片10μm冰凍組織切片后提取，淋巴瘤細胞總RNA直接從激光微切割的細胞中提取，操作參照TRIzoL試劑盒說明書進行。

cDNA合成

通過逆轉錄反應將RNA轉化為cDNA。25μl逆轉錄體系包括：5×逆轉錄緩沖液5μl；dNTP5μl；Oligo-dT2μl；逆轉錄酶MMLV(Promega公司產品)1μl；RNasin0.5μl，淋巴結組織模板為1μg總RNA，激光微切割的淋巴瘤細胞模板為所有微切割產物提取的總RNA產物。反應條件：42℃60分鐘，90℃5分鐘，4℃保存。

實時定量PCR

BCL-XL和TBP（humantranscriptionfactorIID/TATAbindingprotein）的TaqMan定量PCR試劑購自PEAppliedBiosystems公司，通過ABIPRISM7700定量PCR儀檢測。TBP作為內參校正樣本量，同時將表達BCL-XL的Jurkat細胞系［9］作對照。定量PCR結果參照2(-ΔΔCT)法計算［10］，所示數值為每個標本BCL-XL表達量和Jurkat細胞BCL-XL表達量的比值。

PCR直接測序

采用Taq酶（購自申友公司）通過PCR法擴增BCL-XL各目的片段。PCR反應體系為25μl。擴增條件：預變性94℃5分鐘；循環條件為94℃變性30秒,退火溫度為54-60℃（根據各引物不同而改變）,退火時間為30秒，72℃延伸50秒，共35個循環；72℃7分鐘。擴增啟動子區與外顯子的引物序列如下：啟動子區上游引物：5′TGCGGGGATGCCGGTAACTC3′；下游引物：5′GCCTCACCCTCACCCAGTCT3′；1號外顯子上游引物：5′TAATAGGGATGGGCTCAACC3′；下游引物：5′CTTCGCAATTCCTGTGTCGC3′；2號外顯子上游引物：5′AAGAAAAGGGACACACAAGG3′；下游引物：5′TGAGTGAGCAGGTGTTTTGG3′；3號外顯子上游引物：5′ATACCTGCCAGCCTCCTTTG3′；下游引物：5′TTTCCCCACCCACCTACATC3′。

PCR產物純化測序

采用蝦堿酶（shrimpalkalinephosphatase,SAP）和外切酶（exonucleaseI）純化PCR產物。反應體系：4μlPCR產物（30ng/μl）；0.5μlSAP（3.3U/μl）；0.5μlExon1（20U/μl）；用ddH2O定容至10μl。反應條件：37℃60分鐘，80℃15分鐘。純化產物經電泳定量，將濃度調整至10ng/μl后采用ABI3700自動測序儀（PEBiosystems公司）進行直接測序。

統計學分析

數據以均數±標準差（X±SD）表示，使用t檢驗分析。患者隨訪截止期為2005年6月，總生存期（OS）即患者從診斷到死亡或隨訪截止期的時間。生存分析按照Kaplan-Meier法進行，應用Log-rank和χ2檢驗，P值小于0.05具有統計學意義。所有處理均用SAS8.2統計軟件完成。

結果

非霍奇金淋巴瘤BCL-XL表達

與反應性增生淋巴結相比，濾泡性淋巴瘤組織的BCL-XL表達顯著升高（P=0.0064），而在T細胞淋巴瘤和彌漫性大B細胞淋巴瘤與之相比無顯著差異（表1）。Table1.BCL-XLExpressioninNon-Hodgkin′sLymphoma（略）

濾泡性淋巴瘤細胞表達BCL-XL

運用微切割技術從濾泡性淋巴瘤組織切片中直接分離淋巴瘤細胞，運用定量PCR法檢測BCL-XL表達。結果表明，與反應性增生的淋巴細胞相比（2.79±0.59），微切割的濾泡性淋巴瘤細胞高表達BCL-XL（9.00±4.26，P<0.0001）。

濾泡性淋巴瘤BCL-XL表達與疾病進展和患者預后相關

在濾泡性淋巴瘤中，具有多發淋巴結外浸潤、血清乳酸脫氫酶水平升高和國際預后指數分組（internationalprognosticindex,IPI）為高危組的患者BCL-XL表達顯著升高（P值分別=0.0004、0.0019和0.0013）（表2）。在T細胞淋巴瘤和彌漫性大B細胞淋巴瘤中無上述差異。Table2.BCL-XLgeneexpressionoffollicularlymphomapatientsinrelationtoclinicalcharacteristics（略）

根據淋巴結反應性增生組BCL-XL的平均值（3.13）將濾泡性淋巴瘤患者分組，BCL-XL相對高表達的患者（>3.13，A組，n=20）2年和5年OS分別為94.74%和43.21%，顯著低于BCL-XL相對低表達的患者（<3.13，B組，n=10，2年和5年OS均為100%，P=0.0451）（圖1）。在T細胞淋巴瘤和彌漫性大B細胞淋巴瘤中，BCL-XL表達與患者生存無顯著相關。

BCL-XL基因突變分析

運用PCR產物直接測序法，我們在78例非霍奇金淋巴瘤中發現1例濾泡淋巴瘤的BCL-XL基因伴不改變氨基酸的同義突變密碼子109ACA→ACC（圖2），突變發生率為1.28%,與NCBI的SNP數據庫和60例正常人比較后未見相同的變異。

討論

細胞凋亡是由于細胞內外環境變化或死亡信號觸發所引起的細胞主動死亡過程，在細胞增殖和腫瘤發生等過程中起著十分關鍵的作用。然而，凋亡的調控基因根據腫瘤類型的不同而有所改變。與侵襲性較高的T細胞淋巴瘤和彌漫性大B細胞淋巴瘤相比，低度惡性的濾泡性淋巴瘤中高表達BCL-XL，說明凋亡異常在“惰性”淋巴瘤中的重要性［5］。淋巴瘤組織中除淋巴瘤細胞以外，還包含炎性細胞，基質細胞以及正常細胞，后者可能影響基因研究的特異性和敏感性。本研究中，我們通過激光微切割技術直接選取了濾泡性淋巴瘤細胞進行定量PCR檢測。結果表明，微切割的淋巴瘤細胞與反應性增生的淋巴細胞相比，前者BCL-XL表達的水平更高，這進一步證實了高表達的BCL-XL是濾泡性淋巴瘤細胞本身表達的。與BCL-2相似，BCL-XL可穩定線粒體膜通透性，通過減少凋亡因子的釋放而抑制細胞凋亡。然而，BCL-XL除與BCL-2具有相同的抑制細胞凋亡的作用外，還可在功能上替代后者，挽救因BCL-2缺失而致的淋巴細胞凋亡，這在BCL-2-/-的BCL-XL轉基因小鼠中已被證實［11］。同時在高表達BCL-2的濾泡淋巴瘤細胞中，下調BCL-XL的表達，淋巴瘤細胞將隨之發生凋亡［12］。因此，BCL-XL是影響濾泡性淋巴瘤細胞凋亡的關鍵因素［13］。深入的研究表明，BCL-XL高表達與患者的疾病進展密切相關。腫瘤細胞凋亡受抑，浸潤各臟器，表現為診斷時即具有多處淋巴結外累及；同時腫瘤負荷增加，表現為血清乳酸脫氫酶升高；相應地，患者的國際預后指數分期多位于高危組。更重要的是，已知BCL-XL可抑制CD40和化療藥物介導的腫瘤細胞的凋亡［14，15］，BCL-XL高表達的患者預后不良，這從另一角度反映了腫瘤細胞的耐藥性。為探索其異常表達的機制，我們檢測了BCL-XL的突變情況。結果在78例非霍奇金淋巴瘤僅發現1例濾泡淋巴瘤存在突變，但為同義突變，不改變氨基酸序列。Yamaguchi等［16］在50例非霍奇金淋巴瘤中也僅發現1例彌漫性大B細胞淋巴瘤有BCL-XL突變。因此，BCL-XL在淋巴瘤細胞中具有高度保守性，其表達上調的原因有待于進一步研究。綜上所述，BCL-XL的異常表達在濾泡性淋巴瘤發生進展中具有一定的作用，可作為濾泡性淋巴瘤一個重要的預后指標和基因治療靶點。

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