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1菲牛蛭地理分布、野生資源情況、生態(tài)習(xí)性和采收季節(jié)

菲牛蛭主要分布在菲律賓、泰國、越南等東南亞地區(qū)及中國的東南、中部和西南部地區(qū)。由于有關(guān)我國菲牛蛭地理分布、野生資源情況以及生態(tài)習(xí)性和采收季節(jié)相關(guān)報道很少，因此，我們對廣西區(qū)內(nèi)具有代表性的靈川、象州、岑溪、博白、防城、隆安、田東等15個縣（市）的菲牛蛭品種生物學(xué)特征、資源數(shù)量分布、生態(tài)習(xí)性和采收季節(jié)進(jìn)行調(diào)查，共收集到水蛭樣品15份。經(jīng)外貌與形態(tài)特征的初步鑒定，與我國水蛭分類學(xué)專家楊潼所描述的菲牛蛭相同，說明區(qū)內(nèi)分布的水蛭以菲牛蛭品種為主。分布在區(qū)內(nèi)各地的菲牛蛭，經(jīng)體重測定差異不顯著，但在數(shù)量上桂東南地區(qū)明顯多于桂西北，欽州、防城野生資源比較豐富，羅城、巴馬等地野生資源稀少。數(shù)量分布的多寡與溫度、雨量、濕度等氣候因素有關(guān)，符合水蛭喜溫、濕、熱的特性。通過樣品的收集為優(yōu)化種苗選擇提供了豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)。

菲牛蛭生態(tài)環(huán)境要求和生態(tài)習(xí)性：根據(jù)野外的考察表明，菲牛蛭喜歡在土壤含鐵量較高、水體呈弱酸性（pH值5.5～7.0）的環(huán)境中繁衍。在野外多發(fā)現(xiàn)于荒蕪的山塘和山?jīng)_田塊或濕草地，尤其是土層深厚、土質(zhì)疏松潮濕,各種水草生長旺盛,并且經(jīng)常有耕牛、人活動，呈土畦式水體相對固定的環(huán)境中多見，常年耕作的田塊和已開發(fā)養(yǎng)殖的山塘或大面積連體的水體中很少發(fā)現(xiàn)。

菲牛蛭的采收季節(jié)：經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，菲牛蛭對溫度反應(yīng)敏感。水溫在25～30℃時，活動最活躍，生長最快，也是繁殖的季節(jié)。在野外當(dāng)水溫低于15℃時便停止活動，因此，每年的11月前后到次年的4月前后很少發(fā)現(xiàn)有菲牛蛭在水中活動，這時它們都進(jìn)入泥土里越冬，這與其為冷血變溫動物，冬季具有冬眠習(xí)性相一致。這樣菲牛蛭的采收時間宜選擇在9～10月份，此時，氣溫下降，菲牛蛭生長速度減慢，但仍在水中，易于捕捉。

2菲牛蛭的化學(xué)成分

2.1菲牛蛭中脂肪酸分析苗艷麗等［5］對廣西產(chǎn)菲牛蛭脂肪酸提取液進(jìn)行氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)分析,共分離出19個峰。與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對照分析,鑒定了16個組分,脂肪酸的相對含量采用總離子流各色譜峰面積歸一化法定量,結(jié)果見表1。實驗共鑒定了菲牛蛭中脂肪酸的16個組分,占脂肪酸總量的97.39%,其中飽和脂肪酸占63.34%，不飽和脂肪酸占34.05%。飽和脂肪酸主要有硬脂酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸等;不飽和脂肪酸主要包括油酸、11-二十碳烯酸等。其中含量最多的是十六烷酸，達(dá)到23.78%，其次是9-十八碳烯酸,含量為12.53%；11-二十碳烯酸含量為11.75%。菲牛蛭中所含的單不飽和脂肪酸,如9-十八碳烯酸和11-二十碳烯酸的含量高于中藥螞蟥中的含量［6］。

表1菲牛蛭中脂肪酸的組成及含量

序號脂肪酸分子式(甲脂)相對含量(%)13-甲基十三酸C15H30O21.022十四酸(肉豆蔻酸)C15H30O22.8834,8,12-三甲十三酸C17H34O27.434十四酸(異構(gòu)體)C15H34O20.655十五酸C16H32O21.48614-甲基十五酸C17H34O21.279-十六烯酸C17H32O23.968十六酸(棕櫚酸)C17H34O223.78915-甲基-十六酸C18H36O26.091014-甲基-十六酸C18H36O23.6511十七酸C18H36O22.78123，7，11，15-四甲基十六酸C21H42O21.77139-十八烯酸C19H36O212.53148-十八烯酸C19H36O25.8115十八酸(硬脂酸)C19H38O210.611611-二十烯酸C21H40O211.75

2.2菲牛蛭中氨基酸的分析苗艷麗等［5］采用HPLC法，測定廣西產(chǎn)菲牛蛭提取液中的氨基酸。并采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行含量測定,結(jié)果見表2。測定結(jié)果表明菲牛蛭中含有18種氨基酸，甘氨酸的含量最高為5392.70μg/g，其次是亮氨酸含量為2340.59μg/g。其中含有人體必需的7種氨基酸,這7種必需氨基酸含量為5536.28μg/g，占氨基酸總量的28.16%；高于其他水蛭（日本醫(yī)蛭為22.50%，螞蟥為21.40%）［7］中必需氨基酸的含量。

表2菲牛蛭中氨基酸的組成及含量μg·g-1

氨基酸含量氨基酸含量△天門冬氨酸2142.24胱氨酸687.72谷氨酸205.65*纈氨酸512.65絲氨酸606.21*蛋氨酸213.35組氨酸398.94色氨酸320.26△甘氨酸5392.70*苯丙氨酸383.02*蘇氨酸520.21*異亮氨酸1401.29△丙氨酸1478.56賴氨酸899.29△精氨酸1637.35△*亮氨酸2340.59*酪氨酸165.17脯氨酸353.74

*為人體必需氨基酸；△：為含量較高的氨基酸

3菲牛蛭的生物活性成分及其藥理學(xué)作用

3.1菲牛蛭素(Bufrudin)［8］菲牛蛭素是從菲牛蛭分出的一種多肽,由60多個氨基酸組成,分子量7000D，序列分析表明,其中50%～60%的氨基酸殘基與水蛭素相同。其立體結(jié)構(gòu)和構(gòu)型有待進(jìn)一步研究。它的作用機理與水蛭素(Hirudin)、森林山蛭素(Haemadin)相同，都是抑制凝血酶［9］。

黃愛民等［10］從廣西產(chǎn)菲牛蛭消化液中分離出兩種特異凝血酶抑制劑-菲牛蛭素A（BufrudinA,BDA）、菲牛蛭素B（BufrudinB,BDB）。BDA分子量約為15.2KD，等電點為3.97；BDB分子量為14.6KD，等電點為4.61。紫外掃描發(fā)現(xiàn)，BDA在230nm處有最大吸收，而BDB的最大吸收則在200～210nm之間。每1000ml水蛭消化液可以分離出菲牛蛭素A630μg,菲牛蛭素B615μg，收率菲牛蛭素A約為0.303％；菲牛蛭素B約為0.300%。

3.1.1菲牛蛭及活性成分的抗凝血作用黃愛民等［11］用廣西菲牛蛭中提取的兩種菲牛蛭素（菲牛蛭素A和B）在體外及動物體內(nèi)進(jìn)行抗凝血實驗，結(jié)果表明：菲牛蛭素A和B均能明顯延長活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）及凝血酶時間（TT），但兩者的3個指標(biāo)有明顯差異性，其中菲牛蛭素A對凝血酶時間（TT）的作用最顯著，菲牛蛭素B則凝血酶原時間（PT）的作用更強。對于凝血因子，菲牛蛭素A對Ⅱ，Ⅷ，Ⅻ因子產(chǎn)生抑制作用，對Ⅴ，Ⅸ，Ⅹ，Ⅺ因子無影響；菲牛蛭素B則對Ⅱ，Ⅷ，Ⅹ，Ⅻ因子產(chǎn)生抑制作用,對Ⅴ，Ⅸ，Ⅺ因子無影響。廣西菲牛蛭中的抗凝物質(zhì)BDA、BDB均有很強的抗凝活性。

此外，李文等［12］用7種水蛭進(jìn)行全血與血漿復(fù)鈣時間試驗，證實日本醫(yī)蛭與菲牛蛭都表現(xiàn)了強大的抗凝血作用(樣品在10min測試時間內(nèi)不凝)。湖北牛蛭的抗凝效果也十分突出。

3.1.2菲牛蛭及活性成分的抗血栓作用吳志軍等［13］采用大鼠靜脈血栓模型，研究了菲牛蛭制品的抗血栓與溶血栓作用。結(jié)果表明，陽性藥腦血康和4種不同物種的水蛭凍干粉樣品具有明顯的抗血栓作用，各物種抗血栓作用強度依次為菲牛蛭凍干粉>日本醫(yī)蛭凍干粉>歐洲醫(yī)蛭凍干粉>寬體金線蛭凍干粉；同等劑量的菲牛蛭全身凍干粉樣品和陽性藥腦血康具有相當(dāng)?shù)目寡ㄅc溶血栓作用，而菲牛蛭頭部段凍干粉則比前兩者溶血栓效果更佳。

黎淵弘等［14］用廣西菲牛蛭提取物對家兔體外血栓、動脈血栓及大鼠靜脈血栓進(jìn)行抗血栓研究,結(jié)果表明，大(1.5ATU),中(0.75ATU)，小(0.5ATU)劑量組與對照組相比，菲牛蛭提取物對家兔體外血栓形成有顯著性差異（P<0.05）,血栓抑制率為24.3%～100%。與對照組比較，給藥組藥后10，15min對大鼠半體內(nèi)血栓形成影響有顯著性差異(P<0.05),血栓的濕重明顯減小或完全消失。大鼠靜注菲牛蛭提取物60ATU/kg后,大鼠靜脈血栓形成率為0，血栓干濕重為0,與對照組比較有非常顯著性差異(P<0.01)。家兔靜注菲牛蛭提取物60ATU/kg前和給藥后15，30，45min，家兔動脈血栓干濕重有顯著性差異(P<0.05)，藥物作用時間為1h。

3.2纖維蛋白溶解酶筆者采用纖維蛋白平板法［15］定性測定廣西產(chǎn)菲牛蛭唾液提取液纖維蛋白溶解酶。結(jié)果表明：在標(biāo)準(zhǔn)平板和加熱平板上加入廣西產(chǎn)菲牛蛭唾液提取液20μl后，溶圈直徑為0.6cm，表明能溶解纖維蛋白。而尿激酶20μl在標(biāo)準(zhǔn)平板上有較強的纖溶作用（溶圈直徑為1.3cm），在加熱平板上無纖溶作用（溶圈直徑為0）。說明菲牛蛭唾液提取液的纖溶機制與尿激酶不同，是以直接纖溶為主。菲牛蛭唾液提取液經(jīng)過10%～100%硫酸銨處理，部分蛋白被沉淀，由于硫酸銨的量不同，溶圈大小也不同。10%硫酸銨處理樣品上清液的溶圈直徑最大，80%硫酸銨處理樣品上清液的溶圈直徑最小。

3.3抗血小板聚集活性成分李文等［12］從7種水蛭對抗ADP或膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的結(jié)果表明：日本醫(yī)蛭、菲牛蛭和湖北牛蛭都表現(xiàn)了抗血小板聚集的作用。其中以日本醫(yī)蛭的效果最佳。在3.08mg/ml濃度下已表現(xiàn)抑制ADP誘導(dǎo)聚集的作用；其次為菲牛蛭，在9.23mg/ml時對血小板最大聚集率（PAm，%）和1min時血小板聚集率（Par，%）都表現(xiàn)了顯著抑制；湖北牛蛭的抑制ADP誘導(dǎo)血小板聚集作用則需要較高濃度。筆者也發(fā)現(xiàn)，25μl廣西產(chǎn)菲牛蛭唾液提取液對ADP誘導(dǎo)的聚集表現(xiàn)90%的抑制。

3.4抑菌活性成分廣西菲牛蛭唾液粗提液未發(fā)現(xiàn)抑菌活性，但是經(jīng)過離心處理，對金色葡萄球菌有抑制作用，抑菌圈直徑為1.0cm?？赡苁且驗榇謽又谐煞侄喽s，進(jìn)行抑菌檢測時干擾大，而導(dǎo)致陰性結(jié)果。經(jīng)過離心，干擾蛋白被沉淀分離，顯示陽性結(jié)果。

菲牛蛭粗品和菲牛蛭素精品的制備［11］

4.1提取粗品先配制提取液，然后讓菲牛蛭吸吮，待菲牛蛭充分吸飽后，再將其擠壓，收集唾液（水蛭素粗品），每隔3周可提取1次，每條可以反復(fù)提取5～6次，最后還可將整體凍干后粉碎作最后的提取。

4.2廣西菲牛蛭素精品的分離純化

4.2.1廣西菲牛蛭素的粗提取廣西菲牛蛭唾液提取液1000ml，用三氯醋酸進(jìn)行酸沉；4℃，8000r/min離心30min，棄沉淀，取上清液65～70℃保溫30min，適當(dāng)攪拌；調(diào)pH值至中性，4℃，8000r/min離心10min，棄沉淀，保留上清液。

4.2.2廣西菲牛蛭素的提取純化

4.2.2.1DEAE-纖維素柱層析選用的層析柱長為30cm，直徑2.6cm。將上清液加到已用0.02mol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH5.5）平衡的DEAE-纖維素柱上，以0～1mol·L-1NaCl1000ml進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為1ml·min-1，以每管10ml收集各蛋白峰，按Markwardt凝血酶滴定法測定各管蛋白峰的活性，收集具有抗凝活性的A1峰及B1峰。

4.2.2.2SephadexG-50凝膠過濾柱層析選用的層析柱柱長為100cm，直徑1.6cm。取濃縮后的DEAE-纖維素柱的A1峰和B1峰，分離上樣于已用0.02mol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH5.5）平衡的SephadexG-50柱上，用相同緩沖液洗脫，流速為0.3ml·min-1，每管10ml收集蛋白峰，同法測定各蛋白峰的抗凝活性，分別收集具有抗凝活性的A2，B2峰。

4.2.2.3反相HPLC進(jìn)一步純化采用Waters2487DualλAbsorbanceDetector,Waters600controller,WatersTM600Pump.在UV210nm下，選用制備型ULTRASPHEREODSC18柱（10mm×25cm），將DEAE-纖維素柱洗脫的活性峰成分A2，B2透析濃縮后分別進(jìn)樣。用0.1%TFA水溶液充分平衡后，以30min0～60%的乙腈(含0.1%TFA)線性梯度洗脫，流速為3ml·min-1)洗脫，分別收集抗凝活性峰A3，B3，凍干后即得具有抗凝活性的物質(zhì)BDA，BDB。

5菲牛蛭水蛭素基因的克隆和序列測定

譚恩光等［4］以我國廣東菲牛蛭為材料，研究地理因素對菲牛蛭水蛭素基因結(jié)構(gòu)變異的影響。研究表明：廣東菲牛蛭水蛭素基因（Hmg）全長642bp，與馬尼拉的菲牛蛭水蛭素基因Hm1和Hm2同源性分別為9O％和88.6％。從整個多肽鏈看來，廣東菲牛蛭水蛭素基因序列，也具有如下特征：①Hmg的N端第6，13，15，21，27和36位為半胱氨酸，推測這6個半胱氨酸將形成3對二硫鍵，對分子構(gòu)型起穩(wěn)定作用；②Hmg亦含1個富酸性羧基末端片段。此片段中有7個酸性氨基酸，為分別位于50、54、55、59的谷氨酸和位于52，58，60的天冬氨酸。酸性羧基末端片段與凝血酶的識別部位結(jié)合，即帶負(fù)電的羧基末端氨基酸殘基和凝血酶分子結(jié)構(gòu)中帶正電氨基酸形成的凹槽離子鍵相互作用是復(fù)合物形成關(guān)鍵一步，也是發(fā)揮功能的重要一步；③肽鏈中部還有一個由Prc-Lys44——Pro組成的特殊序列，此3個殘基與凝血酶活性部位裂縫相互作用，抑制了此酶的功能［16～18］。此外廣東菲牛蛭水蛭素羧基端不存在來自醫(yī)蛭素中的磺酸化修飾的Tyr，代之是He，這表明水蛭不同科之間，蛭素基因的翻譯后修飾進(jìn)化方式不同。

6菲牛蛭中有害物質(zhì)含量和急性毒性

吳志軍等［13］測定了菲牛蛭中有害物質(zhì)含量和急性毒性試驗。結(jié)果表明：3批不同批號菲牛蛭樣品中銅、鉻、砷、汞、鉛5種有害重金屬元素含量總和<20mg/kg，砷元素含量<2mkg，有機氯類和有機磷類農(nóng)藥殘留量均很低。急性毒性：LD>10g/kg。菲牛蛭中重金屬含量和有機氯以及有機磷農(nóng)藥殘留量均符合國家有關(guān)要求，菲牛蛭可考慮作為一種新的藥用資源加以研究。

我國有水蛭近百種，但《中國藥典》(1995年版)只收載3種，而市場上出售的水蛭藥材實際只有寬體金線蛭一種。筆者認(rèn)為，對其它品種的水蛭尤其是吸血水蛭例如菲牛蛭等，有必要進(jìn)行多學(xué)科的綜合研究，以擴(kuò)大入藥水蛭的品種，造福于人類。

【參考文獻(xiàn)】

［1］KeeganHL,ToshiokaS,SuzukiH.Blood-suckingAsialeechesoffamiliesHirudidaeandHaemadipsidae［R］.Japan:USArmyMedicalCommand,July,1968.

［2］SteinerV.PrimarystructureandfunctionofnoveloglycosylatedhirudinsfromtheleechHirudinariamanillensis［J］.Biochemistry,1992,31:2294.

［3］ScacheriE.NovelhirudinvariantsfromtheleechHirudinariamanillensis,aminoacidsequence,cDNAcloningandgenomicorganization［J］.EurJBioChem,1993,214:295.

［4］譚恩光，劉秀平.廣東菲牛蛭水蛭素基因的克隆和序列測定［J］.中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002，23(2)：84.

［5］苗艷麗，宋文東.菲牛蛭中脂肪酸和氨基酸的分析［J］.福建分析測試（研究簡報），2007，16(2)：49.

［6］劉君，王淳，張穎，等.GC/MS分析中藥螞蟥脂肪酸的組成［J］.分析儀器,2005,2:37.

［7］郭文菊,李長安.水蛭的氨基酸及微量元素分析［J］.中醫(yī)藥研究,1997,13(2):46.

［8］歐興長.水蛭活血有效成分研究概況［R］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志1997，4（2）：60.

［9］ElectricwalaA.IsolationofthrombininhibitorfromtheLeechHirudinariamanillenaia［J］.BloodCoagulationandFibrinolysis，1991，2:83.

［10］黃愛民，黎肇炎，廖共山，等.廣西菲牛蛭消化液中抗凝物質(zhì)的分離純化［J］.中國生化藥物雜志，2006，27（5）：273.

［11］黃愛民，黎肇炎，廖共山，等.菲牛蛭素體內(nèi)外抗凝實驗研究［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2006，23(1):30.

［12］李文，歐長興.七種水蛭抗血小板聚集與抗凝血研究［J］.中藥藥理與臨床，1997，13（5）：32.

【摘要】綜述了我國菲牛蛭的地理分布、野生資源情況、生態(tài)習(xí)性和采收季節(jié)、化學(xué)成分、生物活性成分、藥理學(xué)作用、分離純化以及菲水蛭素基因的克隆和序列測定。認(rèn)為菲牛蛭可作為一種新的藥用資源加以研究。

【關(guān)鍵詞】菲牛蛭化學(xué)成分藥理學(xué)作用