中藥抗氧化作用分析論文
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目前認為中藥成分對機體氧化損傷的保護作用主要包括以下幾方面:
1.1直接清除活性氧自由基自由基又叫游離基,活性氧自由基是一些處于激發態的含氧基團,如超氧陰離子自由基、羥基自由基、烷氧基自由基等。·OH是化學性質最活潑的活性氧,它帶有一個不成對電子,是對人體毒性最大的自由基,它可以與活細胞中的任何分子發生反應而造成損害,而且反應速度極快。O-2·是自由基引起機體中毒的主要原因,可使核酸鏈斷裂、多糖解聚和不飽和脂肪酸過氧化,進而造成膜損傷、線粒體氧化磷酸化等影響。目前制備超氧陰離子自由基的經典方法是鄰苯三酚自氧化法。如陳玫等[3]采用連苯三酚自氧化法,研究浙貝母、茵陳等8種中藥不同提取物的抗氧化活性。結果表明,其中7種中藥都可抑制連苯三酚自氧化,清除超氧陰離子自由基。
1.2增強抗氧化酶活性細胞在生命活動過程內不斷地產生自由基,機體的抗氧化酶通過一系列的催化反應將其轉化為O2和CO2。細胞中的主要抗氧化酶是超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)。SOD是含有Cu,Zn,Mn,Fe等金屬離子,是體內超氧陰離子的主要清除者,將其催化分解為H2O2,H2O2也具有氧化損傷作用,通過過氧化氫酶將其轉化為O2和H2O。同時H2O2也可通過GSH-Px的催化和還原型谷胱甘肽(GSH)反應生成H2O,同時生成還原型谷胱甘肽[4]。如槲皮素能減少胰島β細胞的氧化損傷,同時還能恢復Fe2+致腎細胞損傷動物的SOD,GSH-Px和過氧化氫酶的活力[5]。李波等研究表明楊梅素蕓香苷對氧化損傷性原代培養大鼠肝細胞具有明顯保護作用,其保護作用機理是直接清除氧自由基,增加原代培養肝細胞內抗氧化酶SOD和GSH-Px的活力。
1.3抗脂質過氧化,維持細胞膜穩定性細胞中自由基對細胞的直接損傷作用主要是攻擊細胞膜上的脂質,自由基先和細胞膜上的磷脂或低密度脂蛋白(LDL)的不飽和脂肪酸反應,該反應產物又攻擊附近的不飽和脂肪酸,最終導致鏈式反應的產生。過氧化程度多以其最終產物中丙二醛(MDA)為評價指標[6]。近來有研究認為,部分黃酮類化合物以氫鍵形式與細胞膜結合,保護細胞膜上的不飽和鍵不與自由基接觸,抗脂質過氧化[7]。
1.4減少DNA損傷自由基學說認為,過剩的自由基可以攻擊DNA,引起DNA損傷,從而引發多種疾病。對中藥抗氧化作用的研究目前在某些方面已深入到DNA分子水平[8]。
1.5對氧化酶系活力及表達的影響如對黃嘌呤氧化酶(XO)的影響。XO可將黃嘌呤催化生成尿酸鹽,同時產生超氧陰離子。該過程是缺血/再灌注損傷的一個非常重要的途徑。在機體正常生理狀態下,該酶以黃嘌呤脫氫酶形式存在,在機體處于缺血狀態時,黃嘌呤脫氫酶轉化為XO,當缺血組織再灌注時,XO催化產生超氧陰離子,導致氧化損傷。因此黃嘌呤氧化酶的含量可作為抗氧化研究的指標成分(2005浙江大學碩士論文《八種中藥豆類莢果乙醇提取物及所含楊梅樹蕓香苷抗氧化作用研究》)。
另外,對一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶的影響。正常生理狀態下,NO在舒張血管內皮、維持機體血壓平衡方面起重要作用。但高濃度卻能和活性氧反應后產生氧化能力更高的亞硝基自由基,同時NO也可看作是一種自由基,導致細胞氧化損傷。在缺血再灌注損傷時,NO主要合成酶,誘導型一氧化氮合酶(iNOS)活性增加,大量NO產生而導致氧化損傷形成[9]。研究發現許多黃酮類化合物包括槲皮素、姜黃素在缺血再灌注損傷時可抑制iNOS的活性,而起到抗氧化作用[10]。
2中藥抗氧化活性的評價方法
中藥抗氧化活性的評價方法隨著科學技術的發展和設備的更新而不斷地發展和改變。一些過程繁瑣,準確性不高的評價方法逐漸被淘汰,下面重點介紹一些近年來出現的中藥抗氧化活性評價方法。
2.1二苯代苦味酰基自由基(DPPH)法1958年,Blois首次將DPPH法應用于抗氧化劑的篩選研究,近年來該方法在抗氧化劑研究中受到普遍重視,它克服了傳統方法的一些缺陷,具有快速、簡便、靈敏、易檢測和直接可行的優點,被廣泛用于抗氧化劑的研究,DPPH在有機溶劑中是一種穩定的自由基,其結構中含有3個苯環,1個氮原子上有1個孤對電子,其溶液呈深紫色,在517nm有強吸收。有自由基清除劑存在時,DPPH·的單電子被配對而使其顏色變淺,在最大吸收波長處的吸光度變小,而且這種顏色變淺的程度與配對電子數成化學劑量關系,從而用于評價實驗樣品的抗氧化能力。該反應必須在避光條件下進行,另外反應體系的pH值應調至7.4左右,最好在緩沖液體系中進行。柳艷等[11]利用自由基反應模型觀察丹酚酸B對DPPH自由基的淬滅效應,并結合高效液相色譜(HPLC)技術分別研究溫度和pH值對丹酚酸B清除DPPH能力的影響。為丹酚酸B抗氧化能力的另一作用途徑及其影響因素的研究提供依據。胡博路等[12]采用DPPH法測定30種中草藥乙醇提取液中的抗氧化活性。結果表明五倍子、訶子、大黃、槐花米等9種中藥具有很強的抗氧化活性。康文藝等[13]采用DPPH自由基體系對茜草提取部位進行抗氧化篩選。結果從有活性的氯仿部位分離得到11個化合物,其中3個化合物具有抗氧化活性。
2.2硫代巴比妥酸(TBA)法TBA法是測量脂肪酸,細胞膜和生物組織脂質過氧化的最古老也是應用最多的方法,它還是最容易應用于粗提生物體系的方法,氧化的油脂多生成丙二醛,一分子的丙二醛可同兩分子的硫代巴比妥酸(TBA)作用生成有色化合物,該有色化合物在吸光度530nm左右有吸收。因此,可通過測定丙二醛的量來評價油脂的氧化程度。夏曉凱等[14]通過TBA法測定大鼠肝勻漿自發和誘導的脂質過氧化產物MDA含量,研究黃精多糖(PSP)體外抗氧化作用。鄧勝國等[15]采用TBA法測定和評價荷葉黃酮的抗氧化效果。結果表明荷葉黃酮具有良好的清除自由基能力,能有效抑制亞油酸的氧化。
2.3Fe3+還原/抗氧化能力(FRAP)法FRAP法原理為在較低pH環境下,Fe3+-三吡啶三吖嗪(tripyridyl-triazine,TPTZ)可被樣品中還原物質還原為二價鐵形式,呈現出藍色,并于吸光度593nm處具有最大光吸收,根據吸光度大小計算樣品抗氧化活性強弱[16]。吳青等[17]采用Folin-Ciocalteu方法測定15種中草藥不同提取物總酚含量;用DPPH和FRAP法評估了不同提取物的抗氧化活性。結果表明大花紫薇葉的抗氧化活性最高,其甲醇提取物中酚類物質的含量最高。李云峰等(2004軍事醫學科學院博士論文《石榴皮抗氧化物質提取及其抗氧化抗動脈粥樣硬化作用研究》)以FRAP值為評價指標,按正交設計原則,確定了石榴皮抗氧化物質提取的最佳溶劑和提取條件。另采用細胞培養的方法研究石榴皮提取物抗氧化能力,結果顯示石榴皮提取物能夠提高氧化損傷VEC(Ox-LDL,誘導)的細胞活力,提高細胞抗氧化防御功能。
2.4生物化學發光法清除氧自由基能力評價生物化學發光法測定氧自由基清除作用時,一定濃度范圍內發光強度(CL)與氧自由基數量呈量效關系。清除氧自由基的物質則可以降低CL,根據CL的下降則可以判斷某物質清除氧自由基的能力[18]。流動注射化學發光技術是一種簡單、快速和靈敏度高的方法,可對藥物和植物性食物中活性成分含量及抗氧化性進行測定。劉澤敏等[19]采用反相流動注射化學發光法研究了旱芹、西芹的抗氧化性。實驗結果表明旱芹和西芹提取液均能有效抑制超氧自由基誘導的魯米諾化學發光,并隨著發光體系中提取液濃度的增大,發光強度呈現下降趨勢,且具有較強的抗氧化性,并對旱芹和西芹抗氧化性能進行了比較。吳擁軍等[20]采用Lumino-H2O2-Cu2+化學發光法測定巴戟天提取液的抗氧化活性,同時采用分光光度法分別測定了其對超氧陰離子自由基和羥基自由基的抑制率。該方法靈敏度高、快速測定、操作簡單和重復性好,因此可用于抗自由基活性藥物的篩選。
3討論
由于生物抗氧化劑在體內外的作用非常復雜,盡管一種抗氧化劑在某一種抗氧化體系中抗氧化效果好,但在另一種體系中效果不一定好,故應該建立一套多方案評價體系來評價中藥的抗氧化能力,因此中藥抗氧化作用研究還有大量工作要完成。
【摘要】綜述了中藥抗氧化作用的可能機理和中藥抗氧化作用的評價方法;重點介紹了二苯代苦味酰基自由基(DPPH)法、硫代巴比妥酸(TBA)法、Fe3+還原/抗氧化能力(FRAP)法和生物化學發光法4種目前常用的中藥抗氧化作用評價方法及采用這些方法所取得的研究結果。
【關鍵詞】中藥;抗氧化作用;機理;評價方法
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