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【摘要】目的探討川芎嗪（TMP）對大鼠移植肝的保護作用。方法參照Delriviere和Kamada等方法建立大鼠肝移植模型，將大鼠隨機分為3組：A組（假手術組）、B組（肝移植對照組）和C組（TMP干預組）。采用全自動生化分析儀檢測術后血清肝功能(AST、ALT、LDH)水平；應用免疫組化SP法結合病理圖像分析儀測定肝組織中Bcl-2、Bax的表達情況；HE染色觀察其病理形態學變化。結果（1）C組AST、ALT、LDH明顯低于B組（P<0.01）。（2）C組Bcl-2或Bcl-2/Bax表達明顯高于B組（P<0.05），而Bax表達無明顯變化（P>0.05）。（3）A組無明顯病理形態改變，B組術后肝組織出現明顯的病理損害，C組病理變化明顯減輕。結論TMP可能通過上調Bcl-2或Bcl-2/Bax表達而減輕肝移植體的低溫保存再灌注損傷，對供肝有保護作用。

【關鍵詞】肝移植；保存再灌注損傷；川芎嗪；Bcl-2；Bax

Protectiveeffectoftetramethylpyrazineonlivergraftinratlivertransplantation

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectoftetramethylpyrazine(TMP)preconditioningonlivergraftinratlivertransplantation.MethodsPerformingtheoperationoflivertransplantationinmaleSprague-DawleyratsreferredtoDelriviereandKamadawithcuffanastomosingmethods，theratswererandomlydividedintothreegroups：Agroup(n=6，shamoperationgroup)，Bgroup(n=30×2，livertransplantationcontrolgroup)，Cgroup(n=30×2，TMPgroup).Theparametersofliverfunction(AST，ALTandLDH)weretestedbyauto-biochemicalanalyseringroupBandCafterreperfusion0.5h，3h，6h，24h，48hrespectivelyviatheplasmasamples；partofthelivertissuewassampledtodeterminetheexpressionofBcl-2andBax.TheparametersingroupAwereexamed3haftertheoperation.TheexpressionofBcl-2andBaxwasdeterminedbyimmunohistochemistytechniquewithpathologicalimaginganalyser.Also，partsoflivertissuesampleswereusedtodetectthehistopathologicchanges.Results（1）ThelevelsofAST，ALTandLDHweresignificantlydecreasedingroupCcomparedwiththatingroupB（P＜0.01）afterreperfusion0.5h，3h，6h，24h，48hrespectively.（2）TheexpressionofBcl-2weresignificantlyincreasedingroupCcomparedwiththatingroupB（P＜0.01）afterreperfusion0.5h，3h，6hrespectively.ThedifferentexpressionofBaxbetweengroupCandgroupBwasnonsignificant.（3）ApproximatelynormallymorphologicstructurewasfoundingroupA，someobvioushistopathologicchangesingroupBcouldbeseenmorphologically.ButingroupC，somehistopathologicchangeswerealleviated.ConclusionTMPcanimproveliverfunctionandalleviatehistopathologicdamageinlivertransplantationinratsduringpreservationandreperfusioninjuryprobablybyup-regulatingtheexpressionofBcl-2orBcl-2/Baxandexertaprotectiveeffectonlivergraft.

【Keywords】livertransplantation；preservationandreperfusioninjury；tetramethylpyrazine；Bcl-2；Bax

肝移植是治療終末期肝病最有效的手段，肝移植體低溫保存再灌注損傷是肝移植術后肝原發性無功能（PFN）的重要原因，與細胞凋亡密切相關。目前人們針對凋亡發生的各個環節，探索各種防治方法，從而減輕肝移植體保存再灌注損傷成為了研究的熱點。川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP，四甲基吡嗪）是從中藥川芎中分離、純化的一種生物堿，TMP具有抑制血小板的聚集、改善微循環、保護血管內皮細胞、對抗氧自由基的氧化作用以及鈣拮抗作用；TMP作為鈣拮抗劑，可能通過激活腺苷酸環化酶及抑制鈣離子內流作用而抑制細胞凋亡［1］；TMP還可以影響c-fos表達而抑制細胞凋亡［2］。但目前TMP在細胞內的分子機制研究甚少，需進一步研究。TMP是否影響移植肝保存再灌注損傷細胞凋亡調控基因的表達，尚未見報道。本實驗通過建立大鼠肝移植模型，觀察TMP對保存再灌注損傷中肝組織Bcl-2、Bax表達的影響，探討TMP對大鼠移植肝的保護作用。

1材料與方法

1.1材料封閉群雄性SD大鼠126只，供體體重200～250g，受體體重340～380g，實驗動物購于中南大學實驗動物中心。SSW-3X顯微外科手術器械包（上海醫療器械有限公司）。Q550CW自動病理圖像分析儀（德國LEICA公司）。TMP（40mg/2ml/支，北京第四制藥廠）。Bcl-2、Bax免疫組化試劑盒、AST、ALT、LDH試劑盒（北京中山生物技術有限公司）。

1.2實驗分組及處理封閉群SD大鼠（n=126）隨機分為3個組：A組（n=6，假手術組）、B組（n=30×2，肝移植對照組）、C組（n=30×2，TMP干預組）；B、C組再根據再灌注后0.5h、3h、6h、24h、48h不同時相，又分為5個亞組。

1.3制備大鼠肝移植模型參照Delriviere和Kamada等［3］方法建立大鼠肝移植模型。安體醚吸入麻醉，供體肝上上腔靜脈結扎，供體肝下上腔靜脈與受體右腎靜脈按照Delriviere等［4］方法行袖套吻合（套管內徑為2.0~2.2mm、外徑為2.8~3.0mm）；供肝門靜脈與受體門靜脈行袖套吻合（套管內徑為1.5~1.8mm、外徑為2.0~2.2mm）；結扎受體肝固有動脈；最后將供肝膽管與受體膽管采用套管法重建（內徑為0.65mm、外徑0.96mm硬膜外導管）。B組：灌洗及保存液為4℃冷平衡鹽溶液（含肝素鈉5u/ml）；C組：灌洗及保存液為冷平衡鹽溶液中加TMP（320g/L）；A組：開腹后游離肝周韌帶，分離膽總管及門靜脈，關腹。

1.4標本的采集和檢測B、C組觀察術后的一般情況，并分別于肝移植再灌注后0.5h、3h、6h、24h、48h取腹主動脈血待測肝功能（AST、ALT、LDH），同時取移植肝一小塊肝組織待制石蠟標本；A組于關腹后3h取標本作為正常對照。采用全自動生化分析儀進行肝功能測定；利用免疫組織化學染色的方法結合病理圖像分析測定各切片中細胞凋亡調控基因Bcl-2、Bax表達情況。取部分切片進行常規HE染色，光鏡下觀察肝組織的病理形態學變化。

1.5免疫組化染色方法石蠟切片常規脫蠟至水；3%過氧化氫阻斷內源性過氧化酶活性；微波修復抗原，加封閉用羊血清，37℃孵育15min；加1∶50Bcl-2或1∶50Bax抗體工作液，4℃孵育過夜；滴加生物素的羊抗兔IgM（1∶100），37℃孵育30min；每張切片滴加50μlSP復合物，于37℃孵育30min；以新鮮配制的DAB顯色，蘇木素復染，封片，顯微鏡下觀察。鏡下可見陽性染色主要位于胞漿內，少數為核膜，呈淺黃、棕黃或棕褐色顆粒。每張切片內中外隨機選取6個視野，運用病理圖像分析儀顯微鏡下觀察并測定陽性細胞的輝度值（與Bcl-2、Bax表達成反比）。

1.6統計學方法所有計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，在計算機上用SPSS11.0軟件包處理，方差齊性分析后，組間比較用均數t檢驗，組內比較用單因素方差分析，組內不同時點間兩兩比較采用q檢驗，指標間相關分析用直線相關分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2結果

2.1一般情況本實驗肝移植60例，供體手術時間、血管袖套準備時間、受體手術時間、無肝期分別為（29.65±3.18）min、（9.05±2.12）min、（42.64±4.07）min、（5.18±1.23）min。手術成功率為88.33%（53/60）。本實驗發現，肝移植TMP干預組較肝移植對照組在供肝恢復血流后，其表面很快呈鮮紅色，無花斑狀表現，門靜脈不擴張，肝臟無腫脹，腸管無淤血，腸系膜動脈搏動有力，膽汁源源不斷流出，上述表現明顯優于肝移植對照組。

2.2肝組織形態學變化假手術組（A組）無明顯形態學改變；肝移植對照組（B組）術后肝組織隨著再灌注時間的延長，病理變化逐漸加重：肝細胞排列紊亂，細胞濁腫，變性呈顆粒狀，肝竇變窄，中性粒細胞附壁，繼而出現細胞核染色加深及部分核濃縮，部分還出現點狀或小片狀壞死，以術后6h最嚴重，6h后，病理變化隨著再灌注時間的延長逐漸減輕；肝移植TMP干預組（C組）病理變化較B組相應時點明顯減輕：輕度的組織水腫，肝竇內皮滲出較少，小葉結構基本完好，炎癥細胞浸潤較少（見圖1～2）。

2.3大鼠各組AST、ALT、LDH含量與A組比較，B、C組各時點AST、ALT、LDH含量均顯著性增加（P＜0.01）；與B組相應的時點比較，C組各時點AST、ALT、LDH含量顯著性降低（P＜0.01）；B、C組內各時點間AST、ALT、LDH含量單因素方差分析差異顯著（P＜0.01），且每兩個時點間q檢驗有顯著性時效關系（P＜0.05），見表1。

注：A組AST、ALT、LDH含量分別為（82.78±5.60）u/L、（48.80±4.30）u/L、(564.83±30.66)u/L；與A組比較，△P＜0.01；與B組比較，#P＜0.01

2.4各組Bcl-2、Bax表達輝度值變化與A組比較，B、C組于肝移植缺血再灌注后0.5h、3h、6hBcl-2表達顯著性增加（P＜0.01），Bax表達顯著性降低（P＜0.01）；與B組比較，C組0.5h、3h、6hBcl-2表達顯著性上調（P＜0.01），Bax表達差異無顯著性；并且B、C組內各時點Bcl-2、Bax表達差異有非常顯著性（P＜0.01），且每兩個時點間q檢驗有顯著性時效關系（24h與48h間例外）（見表2、圖3～6）。

注：A組Bcl-2、Bax陰性對照值均為（153.09±1.61）/μm2；△與A組各時點Bcl-2值比較，P＜0.01，Bax值P＜0.01；#與B組各時點Bcl-2值比較，P＜0.01，Bax值P＞0.05

2.5肝功能（AST、ALT、LDH）水平與Bcl-2、Bax表達的相關性AST、ALT、LDH水平與Bcl-2的表達呈顯著性負相關，r值分別為-0.39（P＜0.05）、-0.51（P＜0.01）、-0.52（P＜0.01）；AST、ALT、LDH水平與Bax的表達呈顯著性正相關，r值分別為0.71、0.54、0.75，P＜0.01；AST、ALT、LDH水平與Bcl-2/Bax表達呈顯著性負相關，r值分別為-0.73、-0.72、-0.86，P＜0.01。

3討論

肝移植術后肝原發性無功能是肝移植后死亡的主要原因，與肝移植低溫保存再灌注損傷密切相關［5］，其中細胞凋亡在組織細胞的丟失和器官功能衰竭方面發揮著重要作用［6，7］。肝移植體從可逆到不可逆的轉變反映了肝細胞的增殖、分化和細胞凋亡的精細平衡，基因調控是細胞凋亡的重要調控機制［8］。

Bcl-2基因家族是最受關注的基因之一，任何一個死亡啟動子與Bcl-2或Bcl-XL形成異型二聚體時，細胞就可以避免發生凋亡［9］。Bcl-2蛋白是一種膜整合蛋白，主要分布在線粒體內膜細胞膜內表面、內質網、核膜等處，具有抑制凋亡的作用［10］。目前認為其抗凋亡的主要機制是：抑制細胞內織網鈣庫釋放鈣，維持細胞內鈣的穩定；恢復線粒體膜電位和調制線粒體內外膜之間通透性轉變孔（PTP），抑制線粒體釋放促凋亡蛋白質如細胞色素C、凋亡蛋白激活因子（APAF-1）、凋亡誘導因子（AIF）等［11，12］；抑制Caspase如Caspase-9的激活，從而抑制細胞凋亡級聯放大反應［13，14］；直接抗氧化，對抗氧化應激所致的細胞凋亡［15］；抑制凋亡蛋白Bax及Bak的細胞毒作用等。本實驗結果顯示移植肝對照組再灌注0.5h即出現Bcl-2表達增加，與假手術組比較差異有非常顯著性（P<0.01），隨再灌注時間延長，Bcl-2表達進行性降低，肝功能形態損害進行性加重，再灌注后6h最明顯，提示移植肝在保存再灌注損傷中可能通過增加Bcl-2表達而抑制凋亡，但其作用是有限的，隨著再灌注時間延長，其抑制作用逐漸減弱。TPP干預組Bcl-2表達比肝移植對照組顯著性上調（P<0.01），肝功能形態損害明顯減輕，提示TMP可能上調Bcl-2表達，進一步抑制凋亡而保護移植肝。

Bax為Bcl-2家族中的一員，與Bcl-2不同的是，Bax是促進凋亡。其機制可能是通過誘導Caspase的釋放來實現的，而Caspase能激活來自線粒體的細胞色素C，因而可能對抗Bcl-2的抑制細胞凋亡作用［16，17］；Bax的過度表達還可以促進細胞因子缺乏介導的細胞凋亡。本實驗發現Bax的表達在肝移植后，隨著再灌注時間延長逐漸增加，以再灌注6h最明顯，后又進行性下降，24h后基本恢復正常（與假手術組比較），提示移植肝保存再灌注期間可能激發Bax表達而促進細胞凋亡，TMP干預對Bax表達無明顯影響。

綜上所述，川芎嗪可以通過上調Bcl-2或Bcl-2/Bax表達而有效地減輕肝移植體的低溫保存再灌注損傷，對供肝有保護作用。但其上調Bcl-2或Bcl-2/Bax表達的具體機制尚有待進一步研究。

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