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【摘要】目的運用蛋白質組學技術觀察益智健腦顆粒對SAMP8小鼠海馬蛋白質表達的影響，從而探討益智健腦顆粒治療阿爾茨海默病(AD)的部分作用機制。方法將6月齡SAMP820只隨機分為治療組(n=10)和對照組(n=10)，治療組以益智健腦顆粒濃縮液灌胃，對照組以等劑量雙蒸水灌胃。8w后，應用雙向凝膠電泳(2DE)技術分別分離治療組和對照組SAMP8海馬區組織總蛋白，經膠體考馬斯亮藍染色，利用ImageScanner圖像掃描儀及ImageMaster雙向凝膠電泳軟件對圖像進行掃描分析，將有意義的差異蛋白質點經基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDITOFMS)分析得到肽質量指紋圖譜(PMF)，經MSDB和NCBI數據庫查詢，鑒定差異蛋白質點。結果鑒定出治療組13個差異表達大于2倍的蛋白質，其中有8個上調，5個下調。結論益智健腦顆粒可調節SAMP8小鼠海馬組織的多種蛋白質表達,提示該藥具有多靶點治療的作用。

【關鍵詞】益智健腦顆粒；SAMP8小鼠；海馬；雙向凝膠電泳；質譜分析

益智健腦顆粒是董克禮教授多年臨床實踐治療阿爾茨海默病(AD)的中藥處方，臨床上用于治療AD之腎虛血瘀型,取得滿意療效〔1〕，動物實驗研究能改善SAMP8小鼠的學習記憶能力〔2〕。本研究則在臨床觀察及前期動物實驗的基礎上，應用蛋白質組學技術鑒定益智健腦顆粒干預前后P8品系快速老化小鼠(SAMP8)海馬組織的差異表達蛋白質，試圖從蛋白質組水平探討中藥益智健腦顆粒治療AD的作用機制，為臨床用藥提供理論依據。

1材料與方法

1.1動物及分組選用6月齡20只雄性SAMP8小鼠，隨機分為治療組和對照組,每組各10只，由天津中醫學院附屬第一醫院動物部提供。

1.2藥物、試劑與儀器益智健腦顆粒由淫羊藿、鎖陽、川斷、田七等組成，其水提濃縮液，相當于1ml含3g生藥，由湖南德康制藥有限公司加工制成。雙向凝膠電泳試劑：2DQuantKit蛋白定量試劑盒，尿素，硫脲，NP40，TritonX100，二硫蘇糖醇，碘乙酰胺，固相pH梯度干膠條（pH3～10，24cm），IPG緩沖液（pH3～10），兩性電解質（pH3～10），覆蓋液，雙向凝膠電泳標準蛋白質，考馬斯亮藍G250,溴酚藍均為瑞典AmershamBiosciences公司產品；瓊脂糖，過硫酸氨,丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，甘氨酸，三羥甲基氨基甲烷，CHAPS和十二烷基硫酸鈉，碳酸氫銨，三氟乙酸、乙腈和基質α氰基4羥基肉桂酸均為美國SigmaAldrich公司產品。胰蛋白酶，美國Promega公司產品。PDQuest雙向凝膠圖譜分析軟件是美國BioRad公司產品，MascotMS/MS數據庫查詢軟件是英國Matrixscience公司產品，IPGphor等電聚焦儀，Imagescanner掃描儀均為瑞典AmershamBiosciences公司產品，DataExplorer質譜分析軟件，VoyagerDESTR4307MALDITOFMS質譜儀是美國AppliedBiosystem公司產品。

1.3方法

1.3.1動物喂養及標本收集治療組和對照組小鼠喂養于層流室，溫度18～22℃，濕度55%～58%，飲水及飼料高溫蒸汽滅菌。小鼠灌胃劑量每天30g/kg計算。治療組給予中藥益智健腦顆粒濃縮液灌胃，1次/d。對照組給予相同體積的雙蒸水灌胃，1次/d，持續8w。8w后，迅速斷頭處死治療組和對照組小鼠，置于冰上，剝出腦組織，用冷生理鹽水沖洗干凈，除去血漬，取出所需的海馬，置于EP管中，迅速置于液氮中保存。

1.3.2海馬組織總蛋白的提取及濃度測定將海馬組織從液氮中取出，立即放入預先稱重的EP管中進行稱重。然后根據50mg樣品組織加入約400μl組織裂解液的比例加入組織裂解液（7mol/L尿素、2mol/L硫脲，2%NP40，1%TritonX100，0.5mmol/LEDTA，40mmol/LTris，4%CHAPS，100mmol/LDTT，5mmol/LPMSF）混合后，用研磨工具使海馬組織充分研磨裂解，室溫下靜置孵育1h，間或渦旋混勻，然后1200r/min，4℃離心1h，吸取上清即為組織的總蛋白質。取少許（5μl）上清液（組織總蛋白質）測定蛋白質濃度。采用AmershamBiosciences公司專門針對蛋白質組學研究的蛋白質抽提設計的2DQuantKit定量試劑盒測定蛋白質濃度。

1.3.3雙向凝膠電泳每塊膠的上樣量1500μg。將膠條槽放置于平臺上，將樣品加入膠條槽中，取出IPG干膠條（pH3～10）置入含蛋白質樣品的膠條槽中，再將膠條槽平行放置于IPGphor等電聚焦儀上進行第一向電泳。等電聚焦電泳結束后，將膠條先后放在平衡緩沖A液(平衡緩沖貯液10ml＋DTT100mg)和平衡緩沖B液(平衡緩沖貯液10ml＋碘乙酰胺250mg)中各平衡15min。然后將膠條轉移至12.5%的PAGE分離膠上端，進行第二向電泳。

1.3.4圖像染色與掃描將凝膠從玻璃板上剝離下來，雙蒸水清洗干凈后用考馬斯亮藍G250的藍銀染色方法進行藍銀顯色，通過掃描儀及掃描軟件進行掃描獲取圖像，使用PDQuest圖像分析軟件進行凝膠圖像分析。

1.3.5質譜分析將蛋白質點從凝膠上切取下來，脫色、酶解后對樣品萃取、點樣。用MALDITOFMS質譜儀中進行分析，獲得肽質量指紋圖譜（PMF），再利用NCBI數據庫進行檢索。

2結果

得到背景清晰、分辨率高、重復性好的2DE圖譜各3張。每張2DE圖譜約有900個蛋白質點，大多數蛋白質點在位置和豐度上是一致的，主要分布在pH4～8的范圍內。選擇差異在兩倍以上的16個蛋白質斑點作為差異表達的蛋白質點進行質譜分析，最后得到鑒定的差異表達蛋白質點為13個(各個蛋白具體在凝膠上的分布見圖1)。這些蛋白質的功能分別涉及到細胞骨架蛋白、代謝相關酶類、信號傳導和激素等多個方面。在治療組中表達上調的有8個，分別為1、2、4、5、9、10、11、13號蛋白，表達下調的有5個，分別為3、6、7、8、12號蛋白。每個蛋白的具體情況見表1。表1差異表達蛋白質信息

3討論

AD發病機制現存在多種假說：能量代謝障礙、激素缺乏、細胞凋亡、淀粉樣蛋白神經毒性作用、炎癥、自由基損傷等。本實驗鑒定的13種蛋白質點，分別涉及到能量代謝、細胞凋亡、細胞骨架、激素等多個方面。肽酰脯氨酰順反式異構酶A(Pin1)屬于微小菌素蛋白的一種酶，Pin1蛋白是一種相對大分子量(18kD)的肽酰脯氨酰異構酶。Pin1與磷酸化的微管相關蛋白(tau)蛋白結合，而磷酸化的tau蛋白聚集形成神經元纖維纏結，這樣就使Pin1過多結合于纖維結上，使可利用的游離Pin1減少或缺乏，從而誘導神經元凋亡，這可能是AD發病機制之一〔3～5〕。有研究表明，外源性Pin1的加入可以恢復tau蛋白使微管聚集的生物學特征，即加入的Pin1與磷酸化的tau蛋白結合，使其異構化，成為磷蛋白磷酸酶2A型(ProteinPhosphatase2A,PP2A)的最適底物，PP2A使tau蛋白去磷酸化，從而恢復tau蛋白使微管蛋白聚集的生物學功能，減少神經纖維纏結的形成〔6〕。磷酸甘油酸激酶(PGK)是糖酵解的關鍵酶，PGK基因發生突變會導致智力減退〔7〕，這個酶是一個有重要價值的、具有潛力的藥物設計的靶標〔8〕。

近年研究發現，雌激素可通過多種途徑和環節影響AD的發生和發展〔9，10〕。流行病學調查表明，絕經后婦女AD的發病率較同齡男性高1.5～3.1倍，原因與絕經后婦女喪失了雌激素的保護作用有關〔11〕。接受雌激素治療的患者腦血流量增加,尤其是在海馬、海馬溝回、顳葉等與認知功能相關的腦區〔12〕。大腦的海馬區與記憶和學習的關系密切，在此區域發現了大量的雌激素受體(ER)。雌激素α受體主要在海馬錐體層神經元中表達，雌激素α受體陽性神經元主要分布在CA3和CA4亞區，而在CA1區較少。AD病理學上的一個重要特征為CA1區較CA3區更易發生神經退變，雌激素α受體分布與AD病理變化部位的高度重合提示雌激素可能參與了AD的發病〔13〕。

中藥益智健腦顆粒是由淫羊藿、鎖陽、川斷、刺五加、柏仁、水蛭、田七等藥物組成的復方，適用于腎虛血瘀型的老年癡呆。本實驗發現，中藥益智健腦顆粒通過改善能量代謝、抑制細胞凋亡、構成細胞骨架、增加激素等多途徑、多靶點治療AD。

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