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【摘要】目的研究草珊瑚總黃酮的提取工藝。方法以草珊瑚為原料，用乙醇為溶劑，利用超聲波輔助提取和水浴法提取草珊瑚總黃酮，利用L9（33）正交實驗方法優化總黃酮提取工藝，采用單因素實驗，測定了乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度等單因素實驗，考察總黃酮提取率與各因素的關系。根據單因素實驗得出的顯著條件進行正交設計，確定最佳工藝條件。結果超聲波法的最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比1∶15、提取時間45min，根據確定的最佳工藝條件，按實驗中的測定方法測得提取的總黃酮含量為69.25mg/g。水浴法的最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比1∶20、提取溫度80℃、提取時間2h，按實驗中的測定方法測得提取的總黃酮含量49.60mg/g。結論超聲波提取不僅在時間上比水浴提取大大縮短，而且實驗過程易于控制，黃酮提取率也比水浴提取提高28.38%。

【關鍵詞】草珊瑚；總黃酮；提取工藝；含量

［Abstract］ObjectiveTooptimizetheextractionprocessoftheflavonoidsfromsarcandraglaber.MethodsUsedsarcandraglaberasrawmaterials，tookethanolextractionmethodsandusedultrasonicwaterbathtoextracttheflavonoids，thenusedL9（33）orthogonalexperimenttooptimizetheextractionprocessofflavonoids.Oneoftheexperimentsisthesinglefactorexperiment.Accordingtothegivenconditionsandmeasuredflavones，whatwewilldoistohavesinglefactorexperimentsaboutdifferentconcentrationsofethanol，feedratio，extractiontimeandtemperature.Accordingtotheremarkableconditionsfromsinglefactorexperiments，wewillhaveanorthogonaldesignandthenselectthebestconditions.ResultsTheoptimumconditionsofultrasonicmethodsarefortheconcentrationof50percentethanol，feedrate1∶15，theextractedtime45minutes，theflavonesin69.25mg/g.Theoptimumconditionsofwaterbathforethanolmethodsareforconcentrationof50percent，feedrate1∶20，theextractedtemperature80℃andtheflavonesin49.60mg/g.ConclusionThetimeusedinultrasonicextractionisgreatlyshorterthanthatofwaterbathandtheexperimentiseasiertocontrolthanthatofwaterbath，andtheextractionrateofflavonoidsalsoraise28.38%thanthatofwaterbath.

［Keywords］sarcandraglaber；flavonoids；extractionprocess；content

隨著草珊瑚在醫藥、獸藥、保健食品及保健用品領域中的應用越來越廣泛，對其有效成分的提取分離顯得越來越重要。黃酮類化合物是草珊瑚中含量最多、最主要的活性成分之一。目前，對草珊瑚總黃酮的提取分離工藝技術研究尚未見有詳細報道，本學位論文擬對草珊瑚總黃酮提取分離工藝技術進行較系統的研究并篩選最佳新技術新工藝。采用正交實驗方法考察沸水提取法及乙醇提取法對草珊瑚總黃酮提取效果的影響；采用中藥高新工程技術大孔吸附樹脂對草珊瑚總黃酮進行分離純化研究，以確定草珊瑚總黃酮最佳提取分離工藝條件及方法。以確定的草珊瑚總黃酮最佳提取工藝對不同季節采收的草珊瑚中總黃酮含量的動態變化，草珊瑚自然存放時間不同對總黃酮含量的影響，貴州草珊瑚根、莖、葉中總黃酮的不同含量進行動態變化研究，以確

定草珊瑚原料的最佳利用時機。從而為生產中最有效的開發利用草珊瑚，獲得草珊瑚總黃酮的最大提取率，發揮草珊瑚的最大經濟效益提供實驗依據及指導，以達到提升草珊瑚藥、食用產品的質量檔次，使其更具三效（高效、速效、長效），三小（劑量小、毒性小、不良反應?。?，三便（便于貯藏，便于攜帶，便于服用）的特點，使其產品能走出國門、出口創匯，有著重要的經濟和社會意義［1］。

1材料與方法

1.1實驗材料原料：草珊瑚購于貴陽花果園藥材市場；NaNO2（固體）（重慶北碚精細化工廠）；95%的乙醇溶液（分析純）（遵義國營化學試劑廠）；Al（NO3）3（固體）（匯源化工有限公司）；NaOH（固體）（天津市化學試劑六廠三分廠）。

1.2實驗器材HH-S2s型恒溫水浴鍋（金壇市環保儀器廠）；UV2755B紫外可見分光光度計（上海分析儀器總廠）；抽濾機（金宇機械有限公司）；JY88（96）-IIN型數控超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技有限公司）；FA1004型電子分析天平（上海天平儀器廠）。

1.3實驗方法

1.3.1黃酮類化合物的超聲波法提取研究超聲波提取方法：取原料草珊瑚5g按實驗要求的料液比加入乙醇，放入準備好的燒杯中，超聲波提取，抽濾液體，取0.3ml加入25ml容量瓶中，再在25ml容量瓶中加入1ml5%的NaNO2溶液，等待6min后，再在25ml容量瓶中加入0.5ml5%的Al（NO3）3溶液，等待6min后，再在25ml容量瓶中加入10ml5%NaOH溶液，并加入60%乙醇溶液定容。等待15min后在500nm處檢測吸光度，然后記錄數據［做空白對比的不加Al（NO3）3］。

超聲波提取過程：（1）稱取草珊瑚5g分別裝入準備好了的燒杯中，在燒杯上填上編號，并記錄好數據。（2）用95%乙醇分別配制50%、60%、70%、80%的乙醇，按正交實驗設計搭配裝入對應號的錐形瓶中。（3）根據以上配置好的原料，放入超聲波儀器中進行提取。（4）將以上提取物過濾，將濾液按照實驗方法測出吸光度，并記錄好數據。

1.3.2黃酮類化合物的水浴提取研究取原料草珊瑚5g按實驗要求的料液比加入乙醇，放入錐形瓶中，水浴鍋加熱，抽濾液體，取0.3ml加入25ml容量瓶中，再在25ml容量瓶中加入1ml5%的NaNO2的乙醇溶液，等待6min后，再在25ml容量瓶中加入0.5ml5%的Al（NO3）3的乙醇溶液，等待6min后，再在25ml容量瓶中加入10ml5%NaOH的乙醇溶液，并加入60%乙醇溶液定容。等待15min后在500nm處檢測吸光度，然后記錄數據［作空白對比的不加Al（NO2）3］。

水浴提取的實驗過程為：（1）稱取草珊瑚5g分別裝入準備好了的錐形瓶中，在錐形瓶上填上編號，并記錄好數據；（2）用95%乙醇分別配制50%、60%、70%、80%的乙醇，按正交實驗設計搭配裝入對應號的錐形瓶中，并用保鮮膜密封好；（3）把錐形瓶放入已準備好的一定溫度的水浴中加熱，2h后取出抽濾液體轉入干凈的燒杯中，并用保鮮膜密封好；（4）將以上的提取物過濾，將濾液按照實驗方法測出吸光度，并記錄好數據。

2實驗結果與討論

2.1標準曲線的制備見圖1。從蘆丁對照儲備液中分別吸取1ml，放入1號、2號容量瓶中（25ml），各加60%乙醇至5ml，加5%NaNO2溶液1.0ml，搖勻放置6min，再加10%Al（NO3）3溶液0.5ml（空白對照不加），搖勻再放置6min，加4%NaOH溶液10ml，搖勻放置15min，從400～600nm處測吸光值：可得出蘆丁在500nm處存在最大吸收峰。

回歸方程：A=0.0095C+0.0016,線性范圍為0～59.82μg/ml，相關系數R2=0.9991

圖1標準工作曲線

首先，精密稱取蘆丁對照品18.6mg，置于100ml量瓶中，加60%乙醇溶解至刻度，搖勻即得對照品溶液。然后，分別精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0和5.0、6.0、7.0、8.0ml對照品溶液置于25ml容量瓶中，各加60%乙醇至5ml，加5%NaNO2溶液1.0ml，搖勻放置6min，再加10%Al（NO3）3溶液0.5ml，搖勻再放置6min，加4%NaOH溶液10ml，搖勻放置15min，在500nm波長處測定吸光度值，以同法配制空白（不加硝酸鋁）對照。顯色劑的配置：含量測定，標準曲線的繪制。所用試劑均為分析純，4%NaOH乙醇溶液（200ml）：稱取8gNaOH置入燒杯中，用200ml60%乙醇溶解。10%Al（NO3）3乙醇溶液（25ml）：稱取2.5gAl（NO3）3置于燒杯中，用25ml60%乙醇溶解。5%NaNO2乙醇溶液（50ml）：稱取2.5gNaNO2置于燒杯中，用50ml60%乙醇溶液溶解［2］。

2.2黃酮提取過程

2.2.1提取方法（1）超聲波提?。壕芊Q取干燥、粉碎的草珊瑚粉末5g置于燒杯中，按實驗要求的料液比加入乙醇溶液浸泡，然后用超聲波提取。

（2）水浴法提?。壕芊Q取干燥、粉碎的草珊瑚粉末5g置于錐形瓶中，按實驗要求的料液比加入乙醇溶液浸泡并用保鮮膜密封好，然后放在水浴鍋上加熱2h，濾去殘渣。

2.2.2樣品測定精密吸取黃酮提取液0.3ml于25ml容量瓶中，分別加入60%的乙醇6ml，再加入5%NaNO21.0ml，搖勻放置6min，加入10%Al（NO3）30.5ml（做空白對照的不加），搖勻放置6min，加入4%NaOH10.0ml，加入60%的乙醇定容至刻度。搖勻放置15min在500nm處測吸光度，利用標準回歸方程計算出濃度。得到標準曲線回歸方程：A=0.0095C+0.0016，相關系數R2=0.9992，根據標準方程可以推導出C=（A-0.0016）/0.0095，C為物質濃度（單位為μg/ml），提取黃酮的質量（mg）=C·25/3·10·V·10-3,提取總黃酮含量=提取黃酮的質量（mg）/原料草珊瑚質量（g）。

2.3超聲波法提取黃酮的單因素實驗設計及正交實驗數據處理

2.3.1乙醇濃度對超聲波法提取效果的影響在五個燒杯中各取5g草珊瑚放入，分別用40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液50ml浸泡后超聲波萃取15min，按以上的含量測定方法測定吸光度值。見表1。表1表明：隨著乙醇濃度的增加，黃酮的提取率也逐漸增加，但是當乙醇濃度超過60%的時候，黃酮的提取率反而降低，是因為隨著乙醇濃度的增大，會使提取粗品中雜質含量增加，黃酮成分含量反而降低。表1乙醇濃度對草珊瑚黃酮提取的影響

2.3.2料液比對黃酮提取效果的影響在四個燒杯中各取5g草珊瑚放入，用60%的乙醇，料液比分別1∶5、1∶10、1∶15、1∶20浸泡后超聲波萃取15min，按含量測定方法測定吸光度值。見表2。表2料液比對草珊瑚黃酮提取的影響表2可見，浸提固液比在1∶10至1∶20的范圍內，浸提固液比在1∶15時提取率最高，但隨后增加溶劑的量對提取率的變化不大，在實際操作中，當浸提固液比過小時，提取液偏少，不利于過濾分離，因此選擇浸提固液比在1∶15較為合適。

2.3.3超聲波萃取時間對黃酮提取效果的影響在四個燒杯中各取5g草珊瑚放入，在料液比1∶10，60%乙醇條件下選擇時間分別為15min、30min、45min、60min進行超聲波萃取，按含量測定方法測定吸光度值。見表3。表3提取時間對黃酮提取的影響由表3可見，隨超聲波提取時間15~30min，吸光度增長0.046，增長程度一般，而提取時間30~45min時，吸光度增加了0.102，幅度大增，而提取時間45~60min時，吸光度增長了0.012，增長程度大大降低。由此可以看出，再增加超聲波提取時間，吸光度增速出現先增強再逐漸減緩趨勢。造成提取物在超聲作用達到一定時間后，提取率增加緩慢或呈下降趨勢的原因可能是在長時間超聲作用下，提取率逐漸向極限值靠近，致使提取率增幅降低。同時超聲作用時間太長，會使提取粗品中雜質含量增加，有效成分含量反而降低，影響提取物有效含量。故45min提取時間是最好的工藝條件。

由以上單因素實驗可得出幾個在實驗過程中，對實驗結果有顯著作用的因素，他們分別是乙醇濃度50%、60%、70%，料液比1∶10、1∶15、1∶20，提取時間15min、30min、45min，運用這些條件做出提取工藝參數設計表（表4），為下面的正交實驗做好準備條件。見表5、6。

由表5可看出R料液比＞R乙醇濃度＞R提取時間，所以本實驗料液比作為主要因素，K1、K2、K3中數據最大者對應的水平為最佳水平，即轉化率最高。本實驗的最佳水平組合是A1B2C3，即最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比1∶15、提取時間45min。表4提取工藝參數設計表表5L9（33）提取工藝條件正交實驗結果表表6最佳工藝條件提取由表6可看出黃酮含量69.25mg/g，比正交實驗中的A1B2C2（乙醇濃度50%、料液比1∶15、提取時間30min）所提取出的黃酮含量還高，證明本次正交設計實驗結論是合理的。

2.4水浴法提取黃酮的單因素實驗設計及其正交實驗數據處理

2.4.1乙醇濃度對水浴法提取效果的影響在四個錐型瓶中各取5g草珊瑚放入，分別用50%、60%、70%、80%乙醇溶液75ml浸泡后，水浴提取2h，按以上的含量測定方法測定吸光度值（表7）。表7乙醇濃度對水浴法提取效果的影響由表7可看出：隨著乙醇濃度的增加，黃酮的提取率也逐漸增加，但從60%～70%，吸光度增長幅度變小即提取的黃酮含量增長幅度變小，當乙醇濃度超過80%的時候，黃酮的提取率反而降低，提取的黃酮含量變小，是因為隨著乙醇濃度的增大，會使提取粗品中雜質含量增加，有效成分含量反而降低，影響提取物有效含量。

2.4.2提取溫度對水浴法提取黃酮效果的影響在四個錐形瓶中各取5g草珊瑚放入，在料液比1∶20，60%乙醇條件下選擇60℃、70℃、80℃、85℃進行水浴法提取，按含量測定方法測定吸光度值（表8）。

由表8可看出在乙醇濃度60%、料液比1∶20的不變條件下，隨著提取溫度的升高，吸光度值也在不斷的增長，60℃~70℃的增長程度是最大的，吸表8提取溫度對水浴法提取黃酮效果的影響光度增長最大，但隨著溫度的繼續升高，吸光度的增長程度越來越小，是因為隨著溫度的增加，提取出來的黃酮參與了其他的反應，故提取的增長率變小了（溫度也不易太高，體積將會大量減少）。

2.4.3料液比對水浴法總黃酮提取效果的影響在四個錐形瓶中按料液比各取草珊瑚放入，在提取溫度70℃、乙醇濃度60%條件下選擇料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30進行水浴法提取，按含量測定方法測定吸光度值（表9）。表9料液比對水浴法總黃酮提取效果的影響表9可見，浸提固液比在1∶15至1∶20的范圍內，吸光度最高，但隨后增加溶劑的量對吸光度的變化不大，在實際操作中，當浸提固液比過小時，提取液偏少，不利于過濾分離，因此選擇浸提固液比在1∶20較為合適。

由以上單因素實驗可得出幾個在實驗過程中，對實驗結果有顯著作用的因素，他們分別是乙醇濃度50%、60%、70%，料液比1∶15、1∶20、1∶25，提取溫度60℃、70℃、80℃，運用這些條件做出提取工藝參數設計表（表10），為下面的正交實驗做好準備條件，見表11、12。表10提取工藝參數設計表表11水浴法提取黃酮L9（33）實驗表表12最佳工藝條件確定表由表11可看出R料液比＞R提取溫度＞R乙醇濃度，所以本實驗料液比作為主要因素，K1、K2、K3中數據最大者對應的水平為最佳水平，即轉化率最高。本實驗的最佳水平組合是A1B2C3，即最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比1∶20、提取溫度80℃。

由表12可看出黃酮含量49.60mg/g，比正交實驗中的A1B2C2（乙醇濃度60%、料液比1∶20、提取溫度80℃）所提取出的黃酮含量還高，證明本次正交設計實驗結論是合理的。

3結論

本文是通過對兩種不同的提取方法對草珊瑚進行總黃酮的提取的研究，以便為以后的提取研究找出合適的實驗條件及設計。兩種不同的方法，同樣的浸提試劑，所提取的黃酮量是超聲波法提取的多于水浴法提取的，實驗得出結果：超聲波法的最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比1∶15、提取時間45min，根據確定的最佳工藝條件，按實驗中的測定方法測得提取的總黃酮含量為69.25mg/g。水浴法的最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比1∶20、提取溫度80℃、提取2h，按實驗中的測定方法測得提取的總黃酮含量49.60mg/g。

超聲波輔助提取的優點有：（1）所用的提取時間較水浴法縮短了兩倍多；（2）實驗過程中不用像水浴法一樣，要注意溫度的控制［3］；（3）所提取的黃酮含量比水浴提取高了28.38%。

提取黃酮量,超聲波法提取的多于水浴法,分析原因可能是：（1）超聲波的空化作用對細胞膜的破壞有助于總黃酮的釋放與溶出；（2）超聲波使浸提劑和提取物不斷震蕩，有助于溶質的擴散；（3）超聲波的熱效應使介質溫度基本維持在60℃，對草珊瑚有水浴效果；草珊瑚分布廣泛，資源豐富，成分多樣。藥理作用廣泛、毒性小，用于治療多種疾病，無明顯副作用。目前已有廠家生產了針、片等劑型，日用化工廠以此為原料，制成草珊瑚牙膏。產生了較好的社會和經濟效益。從文獻資料［4］看來，盡管已進行了生藥學、化學成分、藥理、臨床等方面的研究，但是仍有許多問題有待進一步深入研究。

【參考文獻】

1郁建生，李英倫.草珊瑚研究進展.安徽農業科學，2005，33（12）：2390-2392.

2江蘇新醫學院.中藥大辭典.上海：上海科學技術出版社，1997，57.

3徐志杰.草珊瑚的研究概況.江西中醫學院學報，1994，1：36-37.

4宋秋華，張磊，梁飛，等.黃酮類化合物提取和純化工藝研究進展.山西化工，2007，27（4）：24-27.