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缺失的遺傳學(xué)效應(yīng)

篇1

關(guān)鍵詞：異常孕產(chǎn)史染色體核型分析

中圖分類號：R596 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1004-7484（2011）06-0040-02

異常孕產(chǎn)史包括自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)、曾育畸形兒等，隨著細(xì)胞遺傳學(xué)研究的深入發(fā)展，發(fā)現(xiàn)染色體異常是重要原因之一。為探討染色體異常與異常孕產(chǎn)史的關(guān)系，本文對723對具有上述病史的夫婦進(jìn)行了細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，現(xiàn)將結(jié)果報告如下：

1 資料方法

1.1病例資料

從2005年4月~2011年1月，因有自然流產(chǎn)、死胎、畸胎和新生兒死亡等異常孕產(chǎn)史在我院就診的723對夫婦，其表型、智力均正常，行外周血染色體核型分析。女性年齡21~39歲，男性年齡23~42歲。

1.2染色體檢查方法

采用常規(guī)外周血染色體檢查方法，鏡下每例計(jì)數(shù)30個分裂相，應(yīng)用染色體自動分析儀（CIARS1.0）分析染色體G顯帶核型5個，有異常則增加計(jì)數(shù)和分析數(shù)量，必要時加C帶處理分析。

2 結(jié)果

723對夫婦中，檢出染色體異常核型28例，異常檢出率1.94%，其中男性10例，女性18例。常染色體結(jié)構(gòu)異常28例，其中相互易位23例，羅伯遜易位5例，倒位1例，無常染色數(shù)目異常，異常染色體核型與不良孕產(chǎn)史情況見表1。常染色體異染色質(zhì)多態(tài)性變異136例，性染色體異染色質(zhì)多態(tài)性變異27例。異染色質(zhì)多態(tài)性變異情況見表2。

表1 28例染色體異常核型及主要臨床表現(xiàn)

類別異常核型例數(shù) 主要表現(xiàn)

相互

易位 46,XY,t(4;7)(q33;q22) 1 配偶流產(chǎn)2次

46,XY,t(1;7)(q32;q32) 1 配偶流產(chǎn)4次

46,XX,t(3;16)(q21;q22) 1 流產(chǎn)3次

46,XX,t(2;21)(q31;q22) 1 流產(chǎn)1次

46,XX,t(5;6)(q11;q23) 1 胎兒脊椎裂1次，死胎1次

46,XY,t(11;20)(q23;q13) 1 配偶流產(chǎn)3次

46,XX,t(2;11)(q14;q23) 1 流產(chǎn)4次，母親流產(chǎn)10次

46,XX,t(7;13)(q22;q21) 1 流產(chǎn)3次

46,XX,t(3;5)(q13;q15) 1 流產(chǎn)2次

46,XX,t(5;6)(q12;q26) 1 流產(chǎn)2次

46,XY,t(10;22)(q11;q11) 1 配偶流產(chǎn)2次

46,XY,t(10;18)(p11;p11) 1 配偶流產(chǎn)4次

46,XX,t(13;20)(q21;q12) 1 流產(chǎn)3次

46,XY,t(8;16)(q24;p13) 1 配偶流產(chǎn)2次

46,XY,t(1;3)(q22;q22) 1 配偶流產(chǎn)3次

46,XX,t(3;8) 1 流產(chǎn)5次

46,XX,t(10;13) 1 流產(chǎn)2次

46,XX,t(3;11) 1 配偶流產(chǎn)2次

46,XY,t(1;14) 1 配偶流產(chǎn)3次

46,XY,t(1;18) 1 胎兒腦積水1次，死胎1次

46,XY,t(5;6) 1 配偶流產(chǎn)2次

46,XX,t(4;15) 1 流產(chǎn)4次

羅伯遜易位 45,XX,rob(13;14) 3 各流產(chǎn)2次

45,XX,rob(14;21) 1 流產(chǎn)1次

45,XX,rob(14;22) 3 流產(chǎn)3次

倒位 46,XX,inv(10) 1 流產(chǎn)3次

表2 163例異染色質(zhì)多態(tài)性變異情況

核型例數(shù)

常染色體多態(tài) 46,XX/46,XY,1qh+ 50

46,XX/46,XY,15p+ 13

46,XX/46,XY,inv(9) 13

46,XX/46,XY,22S+ 11

46,XX/46,XY,16qh+ 9

46,XX/46,XY,14s+ 7

46,XX/46,XY,21s+ 7

46,XX/46,XY,9qh+ 6

46,XX/46,XY,15s+ 6

46,XX/46,XY,13s+ 6

46,XX,14p+ 2

46,XX/46,XY,21p+ 2

46,XY,13p+ 1

性染色體多態(tài) 46,XY,Yq+ 23

46,XY,Yq- 4

3 討論

本文對723對異常孕產(chǎn)史夫婦的外周血染色體檢查中檢出染色體異常核型28例，染色體多態(tài)163例，總檢出率13.3%，略高于文獻(xiàn)報道的55%―6%的發(fā)生率，結(jié)果表明，染色體異常是異常孕產(chǎn)史的重要細(xì)胞遺傳學(xué)因素。染色體結(jié)構(gòu)異常中平衡易位是不良孕產(chǎn)史夫婦中最常見的染色體異常，是兩條染色體同時斷裂后，兩個斷片相互交換位置后重接，而形成兩條衍生染色體。染色體平衡易位攜帶者的異常核型可以由父母遺傳而來，也可以在配子形成過程中或胚胎早期卵裂時，發(fā)生新的突變。染色體發(fā)生易位后，一般沒有遺傳物質(zhì)的丟失，所以平衡易位攜帶者表型大多正常，但會影響生育。相互易位攜帶者生殖細(xì)胞形成正常配子僅占有1/18，與親代一樣帶有相互易位染色體的配子占1/18，而16/18的配子有染色體部分重復(fù)或缺失，即遺傳物質(zhì)不平衡。與正常人婚配，16/18幾率的胚胎在臨床上表現(xiàn)為早期流產(chǎn)、胎死宮內(nèi)或生育染色體異常后代。羅伯遜易位的平衡易位攜帶者，其胎兒只有1/6的可能為正常兒，1/6的可能為平衡易位攜帶者，其余的為胎兒死亡或先天畸形兒[1]。

倒位是一條染色體發(fā)生2次斷裂，其中間片段倒轉(zhuǎn)1800后又重新接上。這種倒位攜帶者無遺傳物質(zhì)的丟失，故表型正常，但在生育下一代時理論上可形成4種結(jié)果：一種正常，一種倒位攜帶者，另兩種因染色體片段部分重復(fù)和缺失最終導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、畸形。倒位片段占所在染色體的比例不同，其遺傳效應(yīng)不同，而遺傳效應(yīng)主要決定于重復(fù)和缺失片段的長短。一般來說，倒位片段越短，其重復(fù)和缺失的部分越長，形成配子和合子正常發(fā)育的可能性越小，臨床表現(xiàn)為婚后不育、早期流產(chǎn)和死產(chǎn)的比例越高，娩出子女的可能性相對低；而倒位片段越長，則其重復(fù)和缺失部分越短，其配子和合子正常發(fā)育的可能性越大，娩出畸形胎兒的危險性相對較高[2]。

染色體多態(tài)性在人群中普遍存在，是指表型正常個體的染色體上的微小變異[3] ，表現(xiàn)為Y染色體長臂變異，D/G組染色體短臂變異，1，9，16號染色體的次縊痕的變異以及9號染色體臂間倒位等變異現(xiàn)象。以往多認(rèn)為無臨床效應(yīng)，現(xiàn)今對其研究較多。大Y染色體與胎兒發(fā)育異常、流產(chǎn)之間有著某種聯(lián)系，可能是Y染色體異染色質(zhì)區(qū)DNA過度重復(fù)影響生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂時染色體配對聯(lián)會，使受精卵細(xì)胞分裂、分化異常，從而導(dǎo)致胎停育、缺陷兒出生[4]。小Y是由于Y異染色質(zhì)部分或完全丟失，導(dǎo)致常染色質(zhì)排列松散，結(jié)果造成其基因功能喪失和生成異常；還有研究認(rèn)為是Y染色質(zhì)排列過度緊密影響其基因功能發(fā)揮。D/G組染色體隨體的結(jié)構(gòu)、功能及變異均有可能在染色體不分離及三體的形成中起重要作用，發(fā)生機(jī)制可能是影響患者生殖細(xì)胞的分裂[5]。染色體的次縊痕異染色質(zhì)區(qū)是易發(fā)和誘發(fā)斷裂的部位，由于增加或減少的是異染色質(zhì)，故對個體本身表型影響不明顯，但減數(shù)分裂時可能引起其他染色體不分離導(dǎo)致胎兒染色體異常而流產(chǎn)。9號染色體臂間倒位，不能視為正常多態(tài)，應(yīng)該引起高度重視。對在臨床上檢出的染色體臂間倒位攜帶者再次妊娠時應(yīng)做好產(chǎn)前診斷，指導(dǎo)其生育，避免畸形兒的出生[6]。因此對異常孕產(chǎn)史的夫婦除做常規(guī)檢查外，還要進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，以得出明確的遺傳學(xué)診斷，從而避免盲目治療，進(jìn)行正確的婚育指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)

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篇2

【關(guān)鍵詞】不育癥；男性； Y染色體； AZF；無癥；少癥

已婚育齡夫婦不孕癥的發(fā)病率高達(dá)10%~15%，其中男性不育約占40%，特發(fā)性無癥和嚴(yán)重少是男性不育的主要類型。引起無或嚴(yán)重少的原因極其復(fù)雜，遺傳缺陷是其中的重要原因之一。男性無和嚴(yán)重少患者除染色體異常外，Y染色體長臂有控制生成的無因子（Azoospermia factor，AZF），這一區(qū)域的基因微缺失與無和嚴(yán)重少密切相關(guān)。我們通過對無癥和嚴(yán)重少患者外周血染色體和Y染色體上AZF缺失的檢測，探討了引起無和少的遺傳因素和AZF缺失與表型效應(yīng)的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

來自我院不育門診就診的男性不育患者。根據(jù)世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行常規(guī)分析、果糖測定、脫落細(xì)胞學(xué)檢查等，并排除繼發(fā)感染、輸精管缺如、其它外傷等病癥，經(jīng)確診為無或嚴(yán)重少病例作為研究對象。無癥140例，嚴(yán)重少患者80例。按設(shè)計(jì)表格逐一填寫個人一般狀況、個人發(fā)育史、生育史、既往病史、體格檢查等情況。無癥和嚴(yán)重少病例年齡22~40歲，平均29.03±3.35歲。以我院優(yōu)生門診和沈陽市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科有正常生育史患者的丈夫30例為對照組，以10例正常女性為陰性對照組，年齡24~35歲，平均28.12±2.83歲。

1.2 方法

1.2.1 分析

根據(jù)世界衛(wèi)生組織評估標(biāo)準(zhǔn)，每例患者重復(fù)兩次以上檢測，留取標(biāo)本前應(yīng)禁欲3~5天。無患者，經(jīng)連續(xù)三次分析，并經(jīng)離心沉淀均無者確診為無癥，并排除繼發(fā)感染、輸精管缺如、其它外傷等病癥。密度低于5×106/ml為嚴(yán)重少癥。

1.2.2 激素測定

采用SEROZYME I 磁分離酶聯(lián)免疫測試儀（瑞士）測定血清中卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）激素，試劑為SEROZYME專用進(jìn)口試劑。

1.2.3 染色體檢查

采用本室常規(guī)外周血染色體檢查方法，鏡下每例計(jì)數(shù)30個分裂相，G染色體顯帶核型分析5個。

1.2.4 Y染色體上缺失基因檢測

1.2.4.1 無基因引物

根據(jù)文獻(xiàn)資料，在Y染色體長臂5~6區(qū)30個基因片段位點(diǎn)分別選擇了引物AZFa區(qū)sY84、sY86，AZFb區(qū)sY102、sY134，AZFc區(qū)sY147、sY153、sY157和RBM，引物由中國科學(xué)院微生物研究所合成。它們的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA長度分別為326bp、320bp、218bp、301bp、100bp、139bp、285bp 和825bp。

1.2.4.2 PCR反應(yīng)檢測分析 1）標(biāo)本DNA提取：采集患者外周血3ml，肝素抗凝，3000 rpm離心20min，取白細(xì)胞層加入等量的裂解緩沖液，充分混懸。15000rpm離心3min，去上清，沉淀加入1ml裂解液，重復(fù)1~2次，常規(guī)法提取DNA備用。

2）反應(yīng)條件：25μl反應(yīng)體系100 μl 10×緩沖液（10mM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl2），8μl dNTP混合物（每種核苷酸12.5mM），DNA聚合酶8μl（5UI/μl ），引物濃度按每反應(yīng)體系50pmol加入超純水295μl；混合后分裝每反應(yīng)管22μl，加入模板DNA3μl 。在PE480PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行基因擴(kuò)增。94℃預(yù)變性5min，94℃30sec，54℃45sec，65℃120sec，共完成45個循環(huán)，最后65℃5min延伸，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置4℃冰箱中儲存。3)產(chǎn)物檢測分析：

每PCR反應(yīng)管中加入載樣緩沖液3μl，吸取10μl加樣,用3%瓊脂糖凝膠（含0.5μg /ml，溴化乙啶）電泳，電壓8伏/cm，在紫外透射儀下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 染色體分析

在140例無患者中，發(fā)現(xiàn)19例患者染色體異常，異常率為13.57%，其中47，XXY14例，46，XY，del（Yq12）2例，46，XY，del（Yq）1例，46，XY，inv（9）2例。此外還發(fā)現(xiàn)4例患者Y染色體長臂明顯增大。80例嚴(yán)重少患者中未發(fā)現(xiàn)有染色體異常。

2.2 無基因檢測

2.2.1 在140例無患者中，除14例47，XXY患者未做無基因檢查外，其余全部進(jìn)行8個基因位點(diǎn)的無基因測定。結(jié)果表明，有21例患者有AZF基因缺失，總?cè)笔蕿?0.31%。其中2例sY84缺失，3例sY86缺失， 5例sY102缺失，6例sY134缺失、6例sY147缺失，15例sY153缺失，16例sY157缺失，4例RBM缺失。缺失率分別為1.59%、2.38%、3.79%、4.76%、4.76%、11.90%、12.70%和3.17%。AZFa、AZFb、AZFc、RBM缺失率分別為2.38%、4.76%、16.67%、3.17%。有3例同時存在AZFa、AZFb、AZFc缺失，有3例同時存在AZFb、AZFc缺失，15例為單純AZFc缺失，RBM基因缺失同時伴AZFc缺失。

2.2.2 在80例嚴(yán)重少患者中，有14例患者有AZF基因缺失，總?cè)笔蕿?7.50%。其中AZFb區(qū)域1例sY102和sY134缺失，AZFc區(qū)域5例sY147缺失、11例sY153缺失、12例sY157缺失，1例RBM缺失。缺失率分別為1.25%、1.25%、7.50%、13.75%、15.00%、2.50%。未發(fā)現(xiàn)AZFa區(qū)域的sY84和sY86s缺失，AZFb和AZFc的基因片段缺失率分別為1.25%和17.50%。

2.2.3 30例正常對照組未發(fā)現(xiàn)8種基因片段缺失；10例女性對照，8種引物未擴(kuò)增出產(chǎn)物。

2.3 無癥患者精漿脫落細(xì)胞檢查

在126例無癥患者中，有23例患者檢查到有生精細(xì)胞，103例未見到生精細(xì)胞，21例AZF缺失患者中有4例中有生精細(xì)胞，占19.05%；105例無AZF缺失患者中有19例中有生精細(xì)胞，占18.09%。兩者無顯著差異（P＞0.05）。見表1。

2.4 睪酮、黃體生成素、促卵泡刺激素水平

患者血清中T、LH、FSH激素平均濃度均在正常范圍，無癥患者血清中T、LH、FSH分別為（4.11±1.05）ng/ml、（9.91±6.23）mIU/ml、（10.27±8.25）mIU/ml；嚴(yán)重少癥患者血清中分別為（6.48±2.26）ng/ml、（10.45±5.61）mIU/ml 、（15.02±11.23）mIU/ml；AZF缺失患者分別為（5.04±1.34）ng/ml、（11.21±6.81）mIU/ml、（10.52±8.47）mIU/ml。除無癥T濃度明顯低于嚴(yán)重少癥（P

3 討論

引起無和嚴(yán)重少的原因很多，遺傳物質(zhì)改變是其中主要因素，其中染色體異常約10%~15%，主要以47，XXY占絕大多數(shù)，還有一些結(jié)構(gòu)異常，包括常染色體和性染色體。但是，性染色體數(shù)目異常和Y染色體與常染色體易位均表現(xiàn)有第二性征改變，常染色體和Y染色體部分缺失、增加一般副性征正常。本文無患者染色體異常發(fā)生頻率為13.57%，與文獻(xiàn)報道[1]相吻合。

自從Tiepolo[2]等人首次發(fā)現(xiàn)Y染色體長臂熒光區(qū)缺失的病人生成障礙后，一些學(xué)者對AZF的基因定位、構(gòu)成和遺傳效應(yīng)進(jìn)行了大量的研究。Vergnaud[3]應(yīng)用Y染色體DNA探針建立了人類Y染色體基因圖譜，將Y染色體分為7個區(qū)，長臂為5、6、7區(qū)。Ma[4]對50例無癥和嚴(yán)重少癥缺失部分進(jìn)行DNA探針篩查時發(fā)現(xiàn)4例6區(qū)缺失，且不重疊，揭示AZF是一個基因家族。并首先提出RBM（最初稱YRRM）是無生成基因的候選基因。Vogt等[5]證實(shí)無因子（AZF）位于Yq11的第5、6區(qū)，這兩個區(qū)域有較多的控制發(fā)生的基因片段，分為AZFa、AZFb、AZFc三個區(qū)。目前資料報道，在無癥和嚴(yán)重少癥的患者中，有AZF缺失的約占3%~29%，它是染色體異常導(dǎo)致的無以外的第二個重要因素。

在我們的研究中，126例無癥有21例患者有AZF基因缺失，以AZFc缺失最多，缺失率高達(dá)16.67%。AZFa、AZFb、RBM缺失率較低，而且均伴有AZFc缺失。80例嚴(yán)重少患者中有14例患者有AZF基因缺失，主要以AZFc缺失為主，缺失率為17.50%，AZFb基因片段缺失僅為1.25%，而且未發(fā)現(xiàn)AZFa區(qū)域缺失。所以，Yq11的AZFb、AZFc區(qū)域的微基因缺失是引起無和嚴(yán)重少的主要原因。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)無癥和嚴(yán)重少癥中多數(shù)病例同時微缺失2個以上基因片段，說明AZF是個多基因的大家族，有許多不育基因與之有關(guān)。以往報道RBM基因族是無和嚴(yán)重少精的主要候選基因，RBM在AZFb區(qū)內(nèi)，它的缺失對發(fā)生有影響。我們的結(jié)果是無中RBM缺失率僅占3.17%，而且，同時伴有AZFc缺失。本研究AZFa缺失很少，與以前報道的無與AZFa缺失有關(guān)不大一致，而主要是AZFc缺失,盡管我們對這個區(qū)域檢測的數(shù)量有限，但也提示AZFc區(qū)域的缺失導(dǎo)致生精障礙要比AZFb和AZFa區(qū)域缺失更常見，也有類似文獻(xiàn)報道[6]。

文獻(xiàn)資料表明[7]，睪酮是間質(zhì)Leydig細(xì)胞產(chǎn)生的，除維持男性第二性征和的作用外，睪酮分泌減少將導(dǎo)致發(fā)生減緩。FSH主要促進(jìn)生成和成熟，在青春期FSH可促進(jìn)重量增加和曲細(xì)精管直徑增大。LH可刺激Leyig細(xì)胞合成和分泌睪酮，并將睪酮直接通過間質(zhì)細(xì)胞作用于生精上皮細(xì)胞。我們對患者血清中激素水平測定結(jié)果表明，除無癥睪酮明顯低于嚴(yán)重少患者外，無、少和基因缺失患者的LH、FSH等激素水平均沒有明顯差異，沒有發(fā)現(xiàn)基因缺失與激素變化的關(guān)系。

Vogt[5]等并通過病人的組織分析發(fā)現(xiàn)，AZF基因缺失在同一區(qū)域，發(fā)生受阻也在同一時期。AZFb缺失表現(xiàn)為生殖細(xì)胞成熟障礙，內(nèi)只見精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞，中無。AZFc的表現(xiàn)有兩種，可見精原、精母、精細(xì)胞、；僅見支持細(xì)胞，數(shù)量減少。我們對126例無患者進(jìn)行脫落細(xì)胞檢查，發(fā)現(xiàn)僅有23例患者檢查到有生精細(xì)胞，103例未見到生精細(xì)胞，而且AZF缺失患者中有生精細(xì)胞人數(shù)和無AZF缺失患者中有生精細(xì)胞人數(shù)兩者無顯著差異。因此，AZF微缺失與無或少患者的表型效應(yīng)關(guān)系需進(jìn)一步探討。

我們的研究支持AZF區(qū)域微缺失與無之間有著因果關(guān)系，尤其是AZFc區(qū)的缺失的報道[8]。但是，大部分生成障礙尚未檢查出原因，可能受Yq11缺失多個基因位點(diǎn)影響，我們僅檢測了部分基因片段。此外，AZF的點(diǎn)突變也可能對生成有影響。因此，有關(guān)生成基因的課題尚待深入研究。鑒于染色體異常和AZF微缺失與無、少關(guān)系密切，遺傳學(xué)檢查對男性不育患者的病因診斷有著重要價值。

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篇3

關(guān)鍵詞：醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)；教學(xué)方法；思維能力

中圖分類號：G642.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-9324（2013）42-0129-02

醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)是遺傳學(xué)與醫(yī)學(xué)相結(jié)合的一門邊緣學(xué)科。隨著現(xiàn)代生物學(xué)和現(xiàn)代遺傳學(xué)研究的發(fā)展，醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)成為醫(yī)學(xué)教育中的一門重要基礎(chǔ)課程，是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)之間的橋梁課程。醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的研究對象是人類。人類遺傳學(xué)探討人類正常性狀與病理性狀的遺傳現(xiàn)象及其物質(zhì)基礎(chǔ)。而醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)則主要研究人類（包括個體和群體）病理性狀的遺傳規(guī)律及其物質(zhì)基礎(chǔ)。醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)通過研究人類疾病的發(fā)生發(fā)展與遺傳因素的關(guān)系，提供診斷、預(yù)防和治療遺傳病和與遺傳有關(guān)疾病的科學(xué)根據(jù)及手段，從而對改善人類健康素質(zhì)作出貢獻(xiàn)。[1]筆者經(jīng)過教學(xué)實(shí)踐，切身體會到，在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教學(xué)中注重以下幾個方面的問題，可以取得較為理想的教學(xué)效果。

一、巧用啟發(fā)式教學(xué)，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣

在講授中多提幾個“為什么”，往往能很好地開發(fā)學(xué)生的思維層次，當(dāng)學(xué)生對這些問題產(chǎn)生興趣時，就會孜孜以求，全神貫注。

例如在講遺傳學(xué)緒論部分時，告訴同學(xué)在高考之前都要進(jìn)行常規(guī)色盲的檢測，并出示幻燈片讓學(xué)生觀看，學(xué)生會看到一個色盲檢測的卡片動態(tài)圖，然后提出問題：“為什么高考的時候要做色盲測試呢？你們能辨認(rèn)出色盲檢測卡片的數(shù)字嗎？色盲是否是遺傳病？色盲的致病基因是顯性還是隱性呢？色盲的致病基因是位于常染色體還是性染色體呢？”這一有趣的現(xiàn)象馬上會激起學(xué)生的興趣，這時告訴學(xué)生，解決問題的答案在本次課的講授內(nèi)容，當(dāng)然學(xué)生在以后的聽講中學(xué)習(xí)的主動性就會提高起來。又如在講授多基因遺傳與多基因病這一章節(jié)時，理論性較強(qiáng)，比較枯燥，學(xué)生往往覺得索然寡味，筆者結(jié)合新聞媒體及報紙上關(guān)于高血壓、糖尿病的發(fā)病率逐年上升而且年輕化的趨勢事件的報道，以及生活中經(jīng)常見到痤瘡、小兒肥胖等癥狀，然后質(zhì)疑：“為什么我國高血壓、糖尿病發(fā)病率比較高？這些疾病是由單個基因控制還是多個基因控制？會不會受到后天環(huán)境因素的限制？父母患此類疾病，子病風(fēng)險如何？”學(xué)生往往對日常生活中出現(xiàn)的這一現(xiàn)象會滿懷興趣，這樣再介紹多基因遺傳與多基因病的概念，多基因遺傳特點(diǎn)，多基因病的遺傳特點(diǎn)，多基因病發(fā)病風(fēng)險的估計(jì)時，學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性就被充分調(diào)動起來，能更加透徹地理解所學(xué)的知識，加深印象。在近幾年教學(xué)實(shí)踐中，我體會到精選一些有趣的問題，可以很好地激發(fā)起學(xué)生對醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的興趣和學(xué)習(xí)的能動性，使學(xué)生從“要我學(xué)”轉(zhuǎn)變?yōu)椤拔乙獙W(xué)”，不再認(rèn)為學(xué)習(xí)是一種負(fù)擔(dān)。

二、在教學(xué)中注重學(xué)生思維能力的培養(yǎng)

學(xué)習(xí)知識的目的在于應(yīng)用。在教學(xué)中教師不僅要教給學(xué)生知識，更重要的是要讓學(xué)生運(yùn)用正確的思維方法去分析問題，解決問題，使知識和能力得到同步提高，這將有利于學(xué)生理解和了解遺傳學(xué)的基本概念和基本內(nèi)容，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維方法。[2]（1）培養(yǎng)學(xué)生的對照和比較能力。對相似又有聯(lián)系而又不完全相同的概念我們可以進(jìn)行比較，找出他們的異同點(diǎn)，以澄清易混淆的概念，尋求概念的聯(lián)系和對相關(guān)概念的加強(qiáng)。如在不規(guī)則顯性遺傳中出現(xiàn)的表現(xiàn)度和外顯率這兩個概念，學(xué)生往往容易混淆，首先外顯率是指一定基因型個體形成一定表型的百分率。即某一顯性基因在雜合狀態(tài)下或純合隱性基因在一群體中得以表現(xiàn)的百分比；群體中如帶有某一致病基因的個體100%發(fā)病稱完全外顯，外顯率低于100%時，為不完全外顯或外顯不全。而表現(xiàn)度是指一定基因型所形成表型缺陷的嚴(yán)重程度。表現(xiàn)度不一致是指具有同樣基因型的個體，其表型缺陷嚴(yán)重程度有差異。如成骨不全患者家系中，有的患者僅有藍(lán)色鞏膜或骨折，有的有藍(lán)色鞏膜和骨折，有的有藍(lán)色鞏膜、骨折和耳聾。所以表現(xiàn)度要說明的是在致病基因已經(jīng)表達(dá)的前提下表現(xiàn)的程度如何，是屬于“量”的問題；外顯率闡明基因表達(dá)與否，是屬于“質(zhì)”的問題。通過這種比較就找出了兩者的區(qū)別，抓住了各自的特點(diǎn)。（2）培養(yǎng)學(xué)生的分析綜合能力。全面分析綜合是把事物各部分、各特性結(jié)合成一個整體，有利于對知識的理解以及復(fù)結(jié)。如染色體畸變根據(jù)畸變的類型不同，可分為兩大類即數(shù)目畸變與結(jié)構(gòu)畸變，又可根據(jù)其特點(diǎn)對其進(jìn)一步細(xì)分，引導(dǎo)學(xué)生找出它們的區(qū)別，作出圖表（圖1），在對知識的掌握以及以后的復(fù)習(xí)中就可以一目了然。（3）抓內(nèi)因與外因關(guān)系，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維能力。事物的發(fā)展是由內(nèi)外因共同作用形成的，內(nèi)因是根本，外因是條件。內(nèi)因決定著事物的根本屬性，外因推動發(fā)展。任何孤立內(nèi)外因的關(guān)系的說法都是錯誤的。利用內(nèi)因與外因的關(guān)系有利于學(xué)生理解和了解遺傳學(xué)的基本概念和基本內(nèi)容。我們知道多基因遺傳是指一種遺傳性狀或遺傳病受兩對或兩對以上基因的控制，每對基因彼此間沒有顯性和隱性的關(guān)系，每對基因?qū)Ρ硇偷男?yīng)都很小，但是各對基因的作用有積累效應(yīng)，但是多基因性狀或遺傳病的形成除受微效基因影響外，也受環(huán)境因素的影響，所以這種遺傳方式稱為多基因遺傳或多因子遺傳，又稱復(fù)雜疾病。其中的決定遺傳形狀的多對微效基因也是我們所理解的內(nèi)因，起著關(guān)鍵性的作用，而其中的環(huán)境因素也就是我們所理解的外因，則起著條件性的作用。這樣對多基因病的理解就更深入透徹。總之，啟發(fā)學(xué)生用正確的思維方法來學(xué)習(xí)，可以提高教學(xué)效率，事半功倍。

三、注重多媒體教學(xué)與傳統(tǒng)教學(xué)的結(jié)合

隨著多媒體技術(shù)的日漸成熟，多媒體的傳播技術(shù)已進(jìn)入千家萬戶。這使得學(xué)校里一只粉筆，一張嘴的傳統(tǒng)教學(xué)手段顯得落伍了，多媒體課件應(yīng)運(yùn)而生。[3]如在講授醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的21三體綜合征這一章節(jié)時，在放映患兒圖片的同時附有視頻資料，就能增強(qiáng)學(xué)生對該遺傳病的感性認(rèn)識，幫助學(xué)生理解和掌握，還可以為學(xué)生以后在臨床上進(jìn)行遺傳病的診斷打下基礎(chǔ)，并由此引發(fā)學(xué)生的興趣，充分調(diào)動他們學(xué)習(xí)的主動性和積極性。計(jì)算機(jī)輔助教學(xué)系統(tǒng)已成為高校教學(xué)改革的熱點(diǎn)。盡管多媒體技術(shù)作為現(xiàn)代教學(xué)的重要手段正以它的優(yōu)勢挑戰(zhàn)傳統(tǒng)的教學(xué)模式。但在使用多媒體的同時不應(yīng)忽略傳統(tǒng)的教學(xué)手段，應(yīng)使兩者相輔相成，取長補(bǔ)短，達(dá)到教學(xué)過程的最優(yōu)化。傳統(tǒng)教學(xué)方式有著悠久的歷史和豐富的經(jīng)驗(yàn)，尤其是其以人為本的教學(xué)理念正是現(xiàn)代機(jī)器的盲點(diǎn)。教師在黑板上邊寫、邊畫、邊講解，某些公式和定理的推導(dǎo)過程、某些經(jīng)典題目的解題過程，甚至可以把解決此問題時的思路和爭論融會在講解中，這樣才會引出學(xué)生對知識的興趣，才會將所學(xué)的知識消化、理解。教學(xué)效果會好得多。如在講授兩種單基因病的致病基因位于同一對同源染色體上的傳遞規(guī)律這一章節(jié)時。課本常通過舉例計(jì)算子病風(fēng)險情況。以往教師主要對著多媒體課件來進(jìn)行講解，往往是老師已講述很多遍，而學(xué)生仍未理解。現(xiàn)在通過教師親自板書演示整個演算推理的過程使其生動的展現(xiàn)在學(xué)生面前，再附以講解，就迅速地拉近了多媒體課件與學(xué)生之間的距離，使他們有了身臨其境的感受，情緒被充分地調(diào)動起來，從而增強(qiáng)了學(xué)生對兩種單基因性狀的獨(dú)立與聯(lián)合傳遞規(guī)律及發(fā)病風(fēng)險的認(rèn)識，學(xué)習(xí)興趣和積極性也被激發(fā)起來。多媒體教學(xué)和傳統(tǒng)板書的聯(lián)合應(yīng)用，使得課堂教學(xué)形象化、生動化，提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，學(xué)生對課堂所授內(nèi)容的掌握率也大大提高。

四、注重將遺傳學(xué)的基礎(chǔ)理論與疾病案例相聯(lián)系

醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)授課始終強(qiáng)調(diào)以疾病為中心，以遺傳為基礎(chǔ)，深刻理解遺傳與疾病的內(nèi)在聯(lián)系。[4]因此在各類遺傳病教學(xué)時，引入臨床真實(shí)病例，不僅激發(fā)了學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，而且使學(xué)生在分析討論過程中理解和鞏固基本概念、基礎(chǔ)理論，加深對疾病本質(zhì)的認(rèn)識。例如，我們在講授常染色體以及性染色體遺傳病時選取大量的真實(shí)病例，在課堂上引導(dǎo)學(xué)生逐步分析家系信息，使學(xué)生理解和掌握典型遺傳方式和延遲顯性、遺傳印記、早現(xiàn)遺傳等特殊現(xiàn)象。結(jié)合本教研室老教師多年收集積累的病案多媒體素材，包括遺傳性震顫、遺傳性共濟(jì)失調(diào)、舞蹈病、進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良、結(jié)腸息肉、18三體、貓叫綜合征、唐氏綜合征等多媒體，圖文并用，加大了課堂信息量，增加了直觀性。通過這種方式的教學(xué)，課堂教學(xué)質(zhì)量高，教學(xué)效果明顯，得到學(xué)生好評。

五、以教學(xué)帶科研，科研促教學(xué)，教學(xué)科研互進(jìn)

“在教學(xué)中研究”，更應(yīng)該“在研究中教學(xué)”。[5]作為醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的一線高校教師，面對教學(xué)與科研的雙重任務(wù)。應(yīng)該明確其中教學(xué)是最主要的任務(wù)，科研是為教學(xué)服務(wù)的任務(wù)。如果把科研理解為簡簡單單寫幾篇論文那還是膚淺的，教師只有針對教學(xué)實(shí)際問題而有所選擇地學(xué)習(xí)教育理論，且將自己的領(lǐng)悟應(yīng)用于教學(xué)實(shí)踐中，自己的科研才能表現(xiàn)出其價值。脫離教學(xué)的科研是沒有生命力的。為此我時時將自己的科研成果滲透在教學(xué)中，具體我是這樣做的：首先，我在課堂教學(xué)中既講述前人的論述，也介紹自己在科研中形成的觀點(diǎn)。這樣，縮短了教師、教材、學(xué)生之間的距離，有利于激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，啟發(fā)學(xué)生獨(dú)立思維、培養(yǎng)學(xué)生分析能力與創(chuàng)新精神。其次，從自己的研究體會出發(fā)，引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行相關(guān)課題研究。訓(xùn)練學(xué)生做一個有心人，懂得如何圍繞選定的專題系統(tǒng)地收集、整理資料。比如講到單基因與多基因遺傳病時，我就向?qū)W生詳細(xì)闡述了基因治療的研究思路，例如血友病系X連鎖隱性遺傳病，通過轉(zhuǎn)基因的方法使患者持續(xù)表達(dá)缺失的凝血因子，那么患者的癥狀就會明顯改善。又如，糖尿病屬于多基因遺傳病，通常是由于患者體內(nèi)胰島素含量絕對或者相對不足，疾病發(fā)展到后期，最終常需要借助于胰島素治療，而目前的干細(xì)胞與基因治療的結(jié)合使得糖尿病的根治成為可能，盡管目前還處于臨床前期的研究階段。

醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)發(fā)展很快，新內(nèi)容不斷增加。因此，教師既要把握好教學(xué)大綱所要求的基礎(chǔ)知識、基本理論的教學(xué)，同時又要引導(dǎo)學(xué)生了解學(xué)科進(jìn)展，培養(yǎng)醫(yī)學(xué)生能準(zhǔn)確有效地分析、診斷遺傳病的能力和較強(qiáng)的遺傳優(yōu)生咨詢能力，因此教學(xué)中滲透現(xiàn)代教學(xué)理念，把傳統(tǒng)的以教師為中心的指令性課堂向以學(xué)生為主體的非指令性課堂轉(zhuǎn)換，把教師從單純傳授知識向培養(yǎng)學(xué)生學(xué)習(xí)能力轉(zhuǎn)換，加強(qiáng)與臨床病例的聯(lián)系，提高學(xué)生的醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)素養(yǎng)，培養(yǎng)出高質(zhì)量的醫(yī)學(xué)生，以嶄新的知識體系適應(yīng)分子醫(yī)學(xué)的時代。[6，7]

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篇4

表觀遺傳修飾(epigenetic modification)，如DNA甲基化、組蛋白乙酰化和甲基化、RNA相關(guān)性沉默與細(xì)胞生長、分化、凋亡、轉(zhuǎn)化及腫瘤進(jìn)展相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。白血病的發(fā)生和發(fā)展與表觀遺傳修飾異常直接相關(guān)。本文綜述細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因甲基化，組蛋白翻譯后修飾異常及siRNA對白血病細(xì)胞的作用，為白血病治療提供新策略。

【關(guān)鍵詞】表觀遺傳修飾；白血病；表觀遺傳學(xué)

Epigenetic Modification in Human Leukemia ——Editorial

Abstract Epigenetic modification，which involve DNA methylation，RNA-associated silencing and histone modification，is implicated in cell proliferation，differentiation，survival，apoptosis and malignant transformation. Some leukemogenesis has been shown to be aberrance of epigenetic modification. This paper discussed the potential causes of some of leukemias correlating with the methylation of cell cycle regulation genes，small interference RNA and modification abnormality of histone after translation. The study on epigenetic modification abnormality of leukemia cells provides a new strategy for treatment of leukemia.

Key words epigenetic modification; leukemia; epigenetics

表觀遺傳學(xué)（epigenetics）是指非基因序列改變所致基因表達(dá)水平的變化。表觀遺傳學(xué)研究基因表達(dá)變化，這種變化可通過減數(shù)分裂或/和有絲分裂遺傳，不涉及編碼的DNA序列改變，卻能引起基因表達(dá)水平的異常［1］。表觀遺傳修飾（epigenetics modification）包括三種調(diào)節(jié)性機(jī)制：DNA甲基化，RNA相關(guān)性沉寂和組蛋白翻譯后修飾，這些機(jī)制常與啟動和維持表觀遺傳沉寂有關(guān)［2］，三者不是孤立而是相互作用的。研究表明，表觀遺傳修飾，如DNA甲基化、組蛋白乙酰化和甲基化等影響細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、分化、凋亡、轉(zhuǎn)化以及腫瘤發(fā)展相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄等。白血病的發(fā)生和發(fā)展與表觀遺傳修飾異常密切相關(guān)。

目前認(rèn)為白血病的發(fā)生是復(fù)雜的多步驟的，涉及與細(xì)胞增殖、分化、存活、基因組整合有關(guān)的原癌基因、腫瘤抑制基因和其他細(xì)胞內(nèi)的重要基因。在器官和細(xì)胞水平，機(jī)體對細(xì)胞的轉(zhuǎn)化有內(nèi)在的抵抗或保護(hù)作用，所以腫瘤的發(fā)生是多因素積累的結(jié)果。白血病是一組異質(zhì)性疾病，除了細(xì)胞遺傳學(xué)變化外，還發(fā)現(xiàn)它們都存在一種或多種基因的失活，腫瘤抑制基因不能表達(dá)。因此，白血病的發(fā)生是細(xì)胞遺傳和表觀遺傳改變的結(jié)果。

DNA甲基化與白血病

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)上研究最深入的一種機(jī)制，是一種酶介導(dǎo)的化學(xué)修飾過程。在人類和大多數(shù)哺乳動物，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到DNA上胞嘧啶5碳位置，形成CpG位點(diǎn)，富含CpG區(qū)域稱為CpG島。在大約40%的哺乳動物這些CpG島延伸到DNA的啟動子區(qū)域，導(dǎo)致穩(wěn)定的可遺傳的轉(zhuǎn)錄沉寂，對基因表達(dá)有明顯抑制作用［3］。啟動子區(qū)域的CpG島甲基化能沉寂基因轉(zhuǎn)錄，在正常細(xì)胞中是一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)的手段。然而抑制腫瘤生長的基因發(fā)生異常甲基化是在腫瘤早期就發(fā)生而且一直進(jìn)行的，導(dǎo)致惡性腫瘤表型的表達(dá)。抑癌基因能被這種表觀遺傳機(jī)制沉寂。98種不同原發(fā)性人類腫瘤的基因組篩查揭示，在每種腫瘤平均存在600個異常CpG島甲基化位點(diǎn)［4］，很多甲基化CpG島存在于尚未確定的基因組區(qū)域，也許在腫瘤發(fā)生中扮演重要角色。

腫瘤抑制基因啟動子區(qū)域過甲基化常常是白血病/淋巴瘤發(fā)生的一種重要機(jī)制。白血病細(xì)胞周期異常、增殖失控與細(xì)胞周期蛋白異常表達(dá)或缺失相關(guān)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在78%的急性髓系白血病（AML）、67%的漿細(xì)胞疾病、46%的骨髓增生異常綜合征（MDS）、40%的急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）、13%的非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）存在p15INK4B（p15）基因高甲基化，在B細(xì)胞NHL存在p16INK4A（p16）的高甲基化。追蹤MDS進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，7例p15基因正常的早期患者隨疾病進(jìn)展有5例發(fā)生了甲基化［5］。另一項(xiàng)研究顯示，7例p15基因正常的MDS轉(zhuǎn)化為白血病后5例發(fā)生了甲基化［6］。還有學(xué)者報道，153例NHL中低惡性的41例p16表達(dá)正常，71例高惡性者中41例全部或部分喪失p16的表達(dá)，而發(fā)生由低惡性向高惡性轉(zhuǎn)化的41例在轉(zhuǎn)化前p16表達(dá)正常，轉(zhuǎn)化后35例全部或部分喪失p16的表達(dá)［7］。Reddy等［8］研究蛋白酪氨酸磷酸酶基因SHP1、蛋白激酶基因SYK、細(xì)胞因子信號抑制因子基因SOCS1發(fā)現(xiàn)，在93%（119/130）的白血病/淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤至少存在一種基因的甲基化，在100%的NHL和94%的白血病細(xì)胞株存在SHP1甲基化，SOCS1甲基化率達(dá)30%。應(yīng)用去甲基化處理后可見到SHP1重新表達(dá)，STAT3磷酸化水平降低，結(jié)果提示細(xì)胞因子信號紊亂與這些基因甲基化沉默有關(guān)。細(xì)胞周期蛋白基因甲基化與細(xì)胞因子信號抑制因子基因甲基化導(dǎo)致其表達(dá)異常，白血病/淋巴瘤細(xì)胞增殖失控，MDS細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致血液惡性腫瘤的發(fā)生。

不僅細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞因子信號抑制因子基因發(fā)生甲基化，白血病/淋巴瘤細(xì)胞促凋亡基因同樣也存在過甲基化，而在抗凋亡基因有低甲基化現(xiàn)象。Murai等［7］發(fā)現(xiàn)，在15%的急性淋巴細(xì)胞白血病、17%的急性髓細(xì)胞白血病、21%的多發(fā)性骨髓瘤病人存在促凋亡基因BNIP3基因位點(diǎn)的高甲基化，并且使該區(qū)域組蛋白乙酰化時也能直接促使該基因表達(dá)，因此作者認(rèn)為，BNIP3基因的沉寂是該基因組DNA異常甲基化和組蛋白去乙酰化作用的結(jié)果。van Doorn等［9］在T細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因P73和凋亡相關(guān)基因BCL7a啟動子區(qū)域過甲基化，與DNA修復(fù)有關(guān)的腫瘤抑制基因失活，凋亡信號傳導(dǎo)異常而使細(xì)胞增殖失控。Nakatsuka等［10］在對白血病/淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，促凋亡蛋白激酶DAP（death-associated protein）啟動子基因在B細(xì)胞白血病/淋巴瘤甲基化率為79.4%（27/34例），在T細(xì)胞和NK細(xì)胞白血病/淋巴瘤甲基化率為47.4%（9/19例）和62.5%（15/24例），并發(fā)現(xiàn)DNA甲基化程度高的白血病/淋巴瘤細(xì)胞均耐受凋亡誘導(dǎo)作用，聯(lián)合應(yīng)用去甲基化處理則恢復(fù)對凋亡誘導(dǎo)的敏感性。Chen等［11］應(yīng)用DMBA誘導(dǎo)小鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DMBA處理組抗凋亡蛋白survivin明顯表達(dá)，mRNA合成增加，在藥物未處理組則未測到。同時發(fā)現(xiàn)在DMBA未處理組，survivin基因高甲基化，而DMBA處理組未發(fā)現(xiàn)survuvin基因甲基化，表明survivin的表達(dá)是通過表觀遺傳機(jī)制控制的。這些研究說明表觀遺傳修飾異常是白血病發(fā)生發(fā)展的一種重要機(jī)制。

組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶和去乙酰化酶與

白血病

一些證據(jù)表明組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶（HAT）具有腫瘤抑制功能。如果HAT活性缺失或失調(diào)可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。在許多類型的癌癥中，編碼HAT的基因發(fā)生易位、擴(kuò)增、過表達(dá)和突變。在已知的HAT中，P300和CBP認(rèn)為是腫瘤抑制因子。P300和CBP基因分別位于16p13和22q13，在白血病或治療相關(guān)性MDS中表現(xiàn)染色體移位、重排。在80%的惡性角質(zhì)瘤和急性白血病中發(fā)現(xiàn)P300的雜合性缺失。在急性髓細(xì)胞白血病（AML），因t（8；16）（p11；p13）染色體異常使CBP移位，并和乙酰化酶基因MOZ或同源盒基因MLL融合，在此兩種融合蛋白中，CBP的HAT結(jié)構(gòu)域保持完整。在另一種AML中，t（11；22）（q23；q13）異常導(dǎo)致P300基因重排。MLL基因位于11q23，分別和P300、CBP形成t（11；22）（q23；q13）、t（11；16）（q23；p13）移位融合基因，產(chǎn)生MLL-P300和MLL-CBP融合蛋白。這些染色體異常證明，HAT錯誤靶向的乙酰化在白血病發(fā)生的原因方面起重要作用。在小鼠中發(fā)現(xiàn)MLL-CBP融合蛋白能形成MDS綜合征，并進(jìn)展為髓性白血病［12］。CBP的嗅結(jié)構(gòu)和乙酰化酶活性區(qū)域是致白血病必須的，認(rèn)為MLL的N端部分直接被CBP乙酰化導(dǎo)致白血病的發(fā)生。MLL-CBP的潛在靶點(diǎn)是HOX基因家族，可能導(dǎo)致這些基因異常表達(dá)，引起白血病［13］。

組蛋白去乙酰化酶（HDAC）參與癌癥發(fā)展的證據(jù)來源于急性早幼粒細(xì)胞性白血病中的融合蛋白PML-RARα和PLZF-RARα，利用融合蛋白中的RARα部分，PML和PLZF募集組蛋白去乙酰化酶復(fù)合物至維甲酸（RA）受體α的靶基因阻抑轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞分化。在t（8；21）M2b白血病中，AML1-ETO失去了AML1作為調(diào)控造血和細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄因子的功能，它們招募組蛋白去乙酰化酶復(fù)合體作用于AML1靶基因，抑制AML1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。AML1-ETO融合蛋白中ETO的CRD功能域介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制活性占到50%左右，主要通過與mSin3A結(jié)合而起作用［14］。因此，AML1-ETO致髓系細(xì)胞分化受阻和白血病轉(zhuǎn)化作用可能是通過如下模式實(shí)現(xiàn)的：AML1-ETO仍與DNA上的AML1特異序列結(jié)合，但與野生型AML1不同，融合蛋白AML1-ETO不能啟動P300/CBP引導(dǎo)的組蛋白乙酰化和轉(zhuǎn)錄激活。相反，通過融合蛋白中ETO的鋅指結(jié)構(gòu)域，AML1-ETO募集N-CoR和HDAC，使該復(fù)合物持久地固定于AML1反應(yīng)基因的啟動子區(qū)，維持該區(qū)的組蛋白去乙酰化構(gòu)象，DNA和轉(zhuǎn)錄復(fù)合體不能接近，主動阻抑分化基因轉(zhuǎn)錄［15］。

組蛋白修飾與白血病

組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)修飾的另一機(jī)制，包括組蛋白乙酰化修飾和甲基化修飾。組蛋白賴氨酸的N端乙酰化或去乙酰化修飾改變著核小體的結(jié)構(gòu)，組蛋白中去乙酰化的賴氨酰帶正電荷，被吸引到帶負(fù)電荷的DNA中，產(chǎn)生一種緊密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，抑制轉(zhuǎn)錄。另一方面，組蛋白乙酰化酶使賴氨酰乙酸化移走它們的正電荷，從而導(dǎo)致開放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，加速基因轉(zhuǎn)錄。HDAC從賴氨酸移走乙酰基，可以逆轉(zhuǎn)這一過程從而抑制轉(zhuǎn)錄。核小體中組蛋白的異常去乙酰化可能與HDAC專一性的錯誤調(diào)節(jié)有關(guān)，也與腫瘤轉(zhuǎn)化相關(guān)。組蛋白中賴氨酸被特異性組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶甲基化，一方面核小體中組蛋白 H3的賴氨酸 4甲基化與染色質(zhì)開放構(gòu)象和基因表達(dá)相關(guān)；另一方面，組蛋白 H3中賴氨酸 9的甲基化與染色質(zhì)的濃縮和轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)。這種組蛋白甲基化修飾和組蛋白乙酰化及去乙酰化對基因表達(dá)的影響稱作組蛋白密碼［16］，與基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)相關(guān)，異常時與腫瘤發(fā)生有關(guān)。

人類hDoT1L基因和AF10（一種與MLL和AML有關(guān)的融合蛋白）結(jié)合，通過AF10的OM-LZ區(qū)域介導(dǎo)MLL白血病的發(fā)生，MLL-hDoT1L和MLL-AF10介導(dǎo)的白血病細(xì)胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致一系列白血病相關(guān)基因的上調(diào)，并伴有組蛋白H3 K79的高甲基化［17］。MLL蛋白具有組蛋白H3甲基化轉(zhuǎn)移酶活性，可以通過直接結(jié)合或使Hox基因甲基化而調(diào)節(jié)Hox表達(dá)，在白血病細(xì)胞轉(zhuǎn)化和發(fā)生中有重要作用［18］。Lukasova等［19］研究CML的表觀遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)，CML患者的粒細(xì)胞存在不同程度的組蛋白H3甲基化現(xiàn)象，在CML加速期和白血病期，組蛋白H3甲基化作用明顯增強(qiáng)。在CML慢性期，組蛋白甲基化水平、疾病進(jìn)展和用藥方式?jīng)]有明顯相關(guān)性，甚至在“治愈”的患者仍可見到組蛋白H3甲基化現(xiàn)象，提示在這些患者粒細(xì)胞的染色質(zhì)變構(gòu)調(diào)節(jié)是不完全的。白血病細(xì)胞組蛋白H3甲基化現(xiàn)象提示其染色質(zhì)濃縮的不完整性，可能與白血病細(xì)胞增殖、疾病預(yù)后和復(fù)發(fā)有重要相關(guān)性。

人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因在正常分化細(xì)胞是失活的，而在腫瘤細(xì)胞被再激活。研究在細(xì)胞分化過程中hTERT啟動子活性減低的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)是由于hTERT啟動子基因進(jìn)行性的組蛋白低乙酰化和甲基化積累的結(jié)果［20］，說明細(xì)胞進(jìn)化過程中表觀遺產(chǎn)修飾的復(fù)雜性，低乙酰化和高甲基化對維持細(xì)胞正常功能也是必須的。在急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞，PML-RARα移位基因產(chǎn)生的融合蛋白募集DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶到分化基因啟動子靶點(diǎn)誘導(dǎo)該基因高甲基化和沉默。這種高甲基化作用與白血病發(fā)生直接相關(guān)，維甲酸處理后顯示啟動子基因去甲基化，分化基因在表達(dá)，白血病表型逆轉(zhuǎn)［21］。這個研究結(jié)果提示在白血病細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，遺傳學(xué)異常和表觀遺傳學(xué)異常是互相聯(lián)系的，而表觀遺傳學(xué)的積累對白血病發(fā)生的早期階段是至關(guān)重要的。

RNA相關(guān)性沉默與白血病

RNA沉默（RNA silencing）是一種在真核生物體內(nèi)普遍存在的、發(fā)生在RNA水平的、基于核酸序列特異性的相互作用來抑制基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，在動物中稱為RNA干擾（RNA interference，RNAi）。雙鏈（ds）RNA是RNA沉默起始的關(guān)鍵分子，dsRNA首先被降解為不同長度的小RNA，其中具有21-26個堿基的雙鏈小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）在介導(dǎo)對病毒、轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)座子等外來入侵核酸序列特異性的RNA降解，在防御病毒感染和監(jiān)視外來核酸中起重要作用［22］。RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制，高效抑制基因表達(dá)，能封閉病毒生存和繁殖所必需的基因，產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)。RNAi與白血病發(fā)病關(guān)系的研究未見報道，推測在與病毒密切相關(guān)的白血病/淋巴瘤的發(fā)病中應(yīng)存在RNAi機(jī)制缺陷，未能對入侵的核酸分子（如HTLV，EBV，C型病毒等）起到應(yīng)有的作用，而使這些外來核酸分子復(fù)制整合導(dǎo)致惡性血液病的發(fā)生。

RNAi對白血病實(shí)驗(yàn)性治療已有報道。Wohlbold等［23］應(yīng)用bcr/abl斷裂融合點(diǎn)基因設(shè)計(jì)的siRNA能明顯減少bcr/abl蛋白表達(dá)，對抗bcr/abl蛋白的生化特性，能選擇性抑制依賴bcr/abl的細(xì)胞的生長，而且bcr/abl同源的siRNA能增加伊馬替尼對bcr/abl陽性細(xì)胞的敏感性。Cioca等［24］應(yīng)用C-raf 和bcl-2基因設(shè)計(jì)的dsRNA轉(zhuǎn)染入HL-60，U937，THP-1和K562細(xì)胞，結(jié)果均可以降低C-raf 和Bcl-2蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)這些細(xì)胞的凋亡和增加其對伊托泊甙及柔紅霉素化療的敏感性。Heidenreich等［25］應(yīng)用靶向AML1-MTG8位點(diǎn)的siRNA，能明顯減低AML1-MTG8蛋白水平而不影響野生型AML1的活性。McCarthy等［26］設(shè)計(jì)IL-10的siRNA作用于CLL 的B-1細(xì)胞株LNC，顯示降低IL-10的表達(dá)，使LNC細(xì)胞阻滯在G2/M期，有效地誘導(dǎo)LNC細(xì)胞凋亡。siRNA作為一種使異常基因沉默的理想靶點(diǎn)，其有效性得到公認(rèn)，但還需進(jìn)一步深入研究。

盡管多數(shù)腫瘤是克隆性起源，但同種或同類腫瘤間巨大的異質(zhì)性提示腫瘤的發(fā)生是遺傳因素、表觀遺傳因素和微環(huán)境的選擇性壓力聯(lián)合作用的結(jié)果。表觀遺傳修飾在腫瘤相關(guān)基因表達(dá)中的重要性逐漸被重視，對白血病細(xì)胞表觀遺傳學(xué)異常的研究將為白血病的治療提供新的策略。

【參考文獻(xiàn)】

Epigenetic Modification in Human Leukemia ——Editorial

CHEN Yan，LI Xin-Gang

Institute of Hematology，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Key words epigenetic modification; leukemia; epigenetics

DNA甲基化與白血病

組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶和去乙酰化酶與

白血病

組蛋白修飾與白血病

RNA相關(guān)性沉默與白血病

篇5

一般意義上的遺傳學(xué)指基于DNA序列改變導(dǎo)致基因表達(dá)水平的變化,如基因突變、基因雜合丟失和微星不穩(wěn)定等,表觀遺傳學(xué)指非DNA序列改變,是細(xì)胞內(nèi)除了遺傳信息以外的其它可遺傳物質(zhì)發(fā)生的改變。表觀遺傳學(xué)研究主要包括染色體重塑、組蛋白修飾,DNA甲基化,非編碼RNA調(diào)控等。

真核細(xì)胞的特征是有細(xì)胞核,細(xì)胞核包含了真核生物幾乎所有的遺傳物質(zhì)。真核生物基因組DNA儲存在細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)中,核小體( nucleosome) 是構(gòu)成真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)單位。各核小體串聯(lián)而成染色質(zhì)纖維,核小體DNA長度約為165個堿基對,其中纏結(jié)在組蛋白八聚體周圍的核心DNA( core DNA) 約1. 65圈,約合147個堿基對,而相鄰的核小體之間的自由區(qū)域( linber DNA) 為20 - 50個堿基的長度,也就是基因組的75% ~ 90% 被核小體所占據(jù)。組蛋白八聚體由H2A、H2B、H3和H4各2個拷貝組成,每個核心組蛋白都有兩個結(jié)構(gòu)域: 組蛋白的球形折疊區(qū)和氨基末端結(jié)構(gòu)像一條尾巴( tail) 位于核小體的球形結(jié)構(gòu)以外,可同其它調(diào)節(jié)蛋白和DNA發(fā)生相互作用,染色體的高級結(jié)構(gòu)和基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控都與組蛋白密切相關(guān)。核小體組蛋白的尾巴可以發(fā)揮信號位點(diǎn)的作用。

上面已談到表觀遺傳學(xué)是指非DNA序列改變,而是改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致基因表達(dá)水平的變化。那么,染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變?nèi)绾螌?dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平改變的呢?

其一,在細(xì)胞里,DNA-染色質(zhì)的形式存在,核小體是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位,75% ~ 90% 的基因組存在其中,核心組蛋白的尾巴的各種位點(diǎn)通過多種轉(zhuǎn)移酶的作用,發(fā)生共價修飾,組蛋白通過電荷相互作用( 組蛋白尾巴帶正電荷,DNA帶負(fù)電荷) 如組蛋白乙酰化修飾可以通過電荷中和方式削弱組蛋白-DNA或核小體 - 核小體的相互作用,或引起構(gòu)象的變化,破壞核小體結(jié)構(gòu),使DNA接近轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)構(gòu),激活轉(zhuǎn)錄。

其二,為保證染色質(zhì)的DNA與蛋白質(zhì)的動態(tài)結(jié)合,細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了一系列特定的染色體重塑復(fù)合物,也稱重塑子,它們利用水解ATP的能量通過滑動、重建、移除核小體等方式改變組蛋白與DNA結(jié)合狀態(tài),使蛋白質(zhì)易于接近目標(biāo)DNA。依據(jù)重塑子包含的ATP酶中催化亞基結(jié)構(gòu)域的不同,把重塑子分為SWI/SNF、ISWI、CHD、IN080四大家族。組蛋白修飾后如乙酰化的組蛋白可以募集轉(zhuǎn)錄復(fù)合物進(jìn)入到一個基因位點(diǎn),影響轉(zhuǎn)錄。

2 認(rèn)知過程中的表觀遺傳學(xué)機(jī)制

通過新信息或經(jīng)驗(yàn)獲得的記憶可保持?jǐn)?shù)月、數(shù)年,甚至終生,而長時間保持存活的蛋白質(zhì)或mRNA的半衰期只有24 h,顯然,二者之間存在很大的矛盾,那么記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)到底是什么? 1984年,Crick提出了一個假設(shè),即記憶編碼在染色體的DNA上,雖然當(dāng)時他并不是十分確信,但現(xiàn)已澄清,染色體是信息的攜帶者,而且可以代代傳下去,染色體結(jié)構(gòu)或化學(xué)上的改變與認(rèn)知功能的關(guān)系可作如下的理解: 表觀遺傳學(xué)的改變是對來到大腦的信息、應(yīng)激和神經(jīng)元活性改變做出結(jié)構(gòu)上的適應(yīng),最終將信息帶至并激活特異性基因表達(dá)程序。目前研究證明,在腦的一些區(qū)域發(fā)生的表觀遺傳學(xué)改變?nèi)缃M蛋白的乙酰化、甲基化、磷酸化可以穩(wěn)定地改變動物的行為,包括學(xué)習(xí)、記憶、抑郁、藥物依賴、突觸可塑性等等,為長記憶的形成、鞏固和突觸可塑性的形成、維持提供解釋[5,6,7,8]。

閱讀近十幾年發(fā)表的有關(guān)表觀遺傳學(xué)文章后,解決了長期以來認(rèn)知過程中令人費(fèi)解的一些問題,本文著重介紹在腦的不同區(qū)域( 主要是海馬和腦皮層) 組蛋白修飾和DNA甲基化在認(rèn)知過程中的作用及其可能的機(jī)制。

2. 1組蛋白乙酰化[9,10,11]一系列表觀遺傳學(xué)改變都能影響記憶過程,其中組蛋白乙酰化,具有明確、顯著地促進(jìn)記憶的形成和鞏固。組蛋白乙酰化是通過組蛋白乙酰化酶( HATs) 催化完成的。HATs將帶正電荷的乙酰基轉(zhuǎn)移到組蛋白N末端尾區(qū)內(nèi)賴氨酸側(cè)鏈的-氨基。組蛋白乙酰化酶被分成3個主要家族: GNAT超家族,MYST家族和P300 /CBP家族。將乙酰基從組蛋白移走,由組蛋白去乙酰化酶( HDACs) 催化完成,HDACs被分成4類: Ⅰ類,鋅依賴型HDACs,Ⅱ類和Ⅳ類HDACs,Ⅲ類NAD依賴性HDACs。在哺乳動物中,海馬在記憶形成中起重要作用。許多學(xué)者以海馬區(qū)域作為研究對象,研究了組蛋白乙酰化對條件性恐懼中的背景記憶( contextual memory) 和空間記憶的影響。研究證明組蛋白乙酰化或抑制HDACs活性都能增強(qiáng)條件性恐懼中的背景記憶和Morris水迷宮中的空間記憶以及增加突觸可塑性( synaptic plasticity) 。應(yīng)當(dāng)指出的是,腦中組蛋白乙酰化不是獨(dú)立于其它組蛋白修飾而存在,而是在組蛋白乙酰化的同時,也往往存在組蛋白磷酸化、甲基化。組蛋白乙酰化削弱了組蛋白與DNA之間的靜電親和力,從而促進(jìn)染色體結(jié)構(gòu)接近轉(zhuǎn)錄基因機(jī)構(gòu),引起基因持續(xù)性改變,增加神經(jīng)元活動,乙酰化修飾后的組蛋白也可以募集其它相關(guān)因子[10,11,12,13],如轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,進(jìn)入到基因位點(diǎn),影響轉(zhuǎn)錄。

2. 2 組蛋白乙酰化的調(diào)節(jié)機(jī)制[14,15,16]

2. 2. 1神經(jīng)元活性與組蛋白乙酰化組蛋白乙酰化可由許多類型的神經(jīng)元活性所調(diào)節(jié),例如,KCl介導(dǎo)的神經(jīng)元去極化引起海馬培養(yǎng)中的核心組蛋白H2B乙酰化的增加,再如,特異性受體激動劑可興奮多巴胺能、乙酰膽堿能、谷氨酸能途徑,增加小鼠海馬H3K14和H3S10的乙酰化,在所有這些情況下,組蛋白乙酰化都伴有細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶ERK( MAPK家族中的一員) 的激活,直接激活MAPK-ERK信號途徑可增加組蛋白乙酰化,而MAPK-ERK抑制劑則可阻斷組蛋白乙酰化[16,17,18],這些研究表明,神經(jīng)元活性引起組蛋白乙酰化是通過MAPK依賴性途徑的激活,而且也可能是通過H3S10磷酸化之間的對話。后者常與在蛋白乙酰化同時存在,從染色體脫離的HPAC2引起的神經(jīng)活性,也能改變組蛋白的乙酰化,用BDNF刺激皮層神經(jīng)元,能引起HDAC2在胞嘧啶262和274位的硝基化及隨后組蛋白的高乙酰化及隨后組蛋白的乙酰化,并伴有神經(jīng)營養(yǎng)因子依賴性基因表達(dá)的增強(qiáng)。已知MECP2可增加BDNF的表達(dá),但被HDAC2負(fù)面調(diào)節(jié)。因此,神經(jīng)活性參與了以HDAC2和BDNF為中心的正性反饋,該系統(tǒng)導(dǎo)致組蛋白乙酰化和基因自身的持續(xù)表達(dá)。

2. 2. 2突觸可塑性與組蛋白乙酰化長時程突觸可塑性涉及突觸維持和交流有關(guān)基因表達(dá)的改變,已有充分材料證明,組蛋白乙酰化促進(jìn)這一改變,例如在海兔( Aplysia) 組蛋白乙酰化能誘導(dǎo)長期易化 ( LTF) 并伴有CREB結(jié)合蛋白CBP的增加[19],類似的改變也在突觸素( synapsin) 的啟動子區(qū)域觀察到,突觸素與LTF和LTD均有關(guān)。不過,伴有CREB乙酰化的減少,正常情況下,誘導(dǎo)LTF需施加強(qiáng)電刺激,但如果提前給予RNA干擾( RNAi) ,弱的電刺激也能誘導(dǎo)LTF。這一發(fā)現(xiàn)提示,組蛋白乙酰化程度與突觸可塑性程度密切相關(guān),HDAC1能增加天然存在的突觸傳遞過程,在哺乳動物的LTP也與組蛋白乙酰化水平有關(guān)。LTP誘導(dǎo)可平行出現(xiàn)H3和H4組蛋白乙酰化的增加,從研究中還明顯看出LTP促進(jìn)乙酰化,改變特異地存在于與突觸傳遞有關(guān)基因如Reelin和BDNF啟動子區(qū)域,這一結(jié)果與前述看法一致,即在組蛋白乙酰化過程中存在一個基因自身持續(xù)性改變的正性反饋系統(tǒng)。此外,有關(guān)HATCBP的研究表明,增加組蛋白乙酰化能促進(jìn)LTP,部分或完全缺失CBP功能的小鼠出現(xiàn)組蛋白乙酰化水平的下降和LTP形成受阻。不過,不依賴轉(zhuǎn)錄的早期LTP不受影響。

2. 2. 3記憶形成與組蛋白乙酰化[20,21]在低等生物和哺乳動物進(jìn)行的研究證明,不管哪種記憶類型或哪種記憶時相( 記憶獲得,鞏固和再現(xiàn)) 都能對組蛋白乙酰化進(jìn)行調(diào)節(jié),例如背景性和線索性恐懼記憶( fear memory contextual and fearmemory cued) 都能增加H3乙酰化,小鼠眨眼條件反射( eyeblink conditioning) 和大鼠潛伏抑制 ( latent inhibition) 能分別增加組蛋白H3和H4乙酰化,大小鼠物體識別記憶( Objectrecognition memory) 伴有H3和H4乙酰化的增加,此外優(yōu)先食物轉(zhuǎn)換( social transmission of food preference) 和食物厭惡記憶( food aversion memory) 等均能增加H3乙酰化,空間記憶( spatial memory) 伴有H2B,H3和H4乙酰化。

從上述組蛋白乙酰化研究的論述可得出以下幾點(diǎn)結(jié)論:

( 1) 組蛋白乙酰化,不是脫離開其它組蛋白修飾而獨(dú)立存在,即在發(fā)生組蛋白乙酰化的同時,也有組蛋白磷酸化、甲基化等的發(fā)生,其它表觀遺傳學(xué)改變對組蛋白乙酰化起了協(xié)同作用。

( 2) 神經(jīng)元活性可調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化,神經(jīng)元活性的啟動需要MAPK-ERK信號途徑的激活。

長記憶和突觸長時程增強(qiáng)均涉及許多基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá),最常見和最重要的基因包括即早基因Zif/268,Creb,Bdnf和Reelin等。

( 3) 許多種類的神經(jīng)活性存在一個以BDNF和HDAC2為中心的正性反饋系統(tǒng),該系統(tǒng)可導(dǎo)致組蛋白乙酰化和基因自身持續(xù)表達(dá)程序。

( 4) 在多種生物體和細(xì)胞研究中觀察到各種不同類型的記憶模式和不同記憶時相都能引起組蛋白乙酰化,進(jìn)而促進(jìn)記憶和有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

( 5) 組蛋白乙酰化能引起長記憶的形成和鞏固,但對無須轉(zhuǎn)錄的短記憶和早期LTP沒有影響。

2. 3神經(jīng)元活性是如何引起組蛋白乙酰化,它的作用機(jī)制是什么?[11]途徑之一,神經(jīng)元活性包括LTP和學(xué)習(xí)激活G蛋白偶聯(lián)受體( GPCRs) ,然后依次激活腺苷環(huán)化酶( AC) 產(chǎn)生c AMP,后者激活PKA,PKA磷酸化MEK( MAPK家族中的一員) ,MAPK的家族成員能直接磷酸化組蛋白,隨后啟動組蛋白乙酰化。

途徑之二,神經(jīng)元活性可通過鈣內(nèi)流引起膜去極化,然后激活CAMKⅡ,后者磷酸化甲基-CPG結(jié)合蛋白2( MECP2) ,使MECP2從染色體脫離出來,Calmodulin刺激BDNF啟動子區(qū)域的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。BDNF激活一氧化氮合酶導(dǎo)致組蛋白乙酰化酶2( HDAC2) 的硝基化,在硝基化作用下,HDAC2從染色體中脫離出來并強(qiáng)化硝基化,結(jié)果引起B(yǎng)DNF表達(dá)并參與正性反饋系統(tǒng),進(jìn)而促進(jìn)記憶 - 持續(xù)性基因表達(dá)的改變( 見Fig 1) 。

其他一些學(xué)者的研究工作指出: 激動NMDA受體,抑制磷酸二酯酶( PDE) ,增加細(xì)胞內(nèi)鈣等多種途徑均可激活PKA,PKA則可直接激活CBP,如前所述。含有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的CBP與CREB結(jié)合,是提高突觸可塑性形成長記憶的必備條件; NO啟動組蛋白影響記憶的機(jī)制有二,一是激活N0-cG MP-Ca MKII-CREB磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑; 二是NO依賴性的HDAC的5-硝基化,可增加組蛋白乙酰化,而NO供體與5-硝基谷胱甘肽,可抑制HDAC活性,因而,也能增加組蛋白乙酰化。此外,神經(jīng)元活動或突觸活動引起胞外鈣內(nèi)流入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi),使Me CP2的S421磷酸化,S80去磷酸化,后者從染色質(zhì)分離出來,發(fā)揮對神經(jīng)可塑性和記憶的調(diào)控作用。

2. 4 RNA干擾 ( RNA interference,RNAi)指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA( dsRAN) 介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解,導(dǎo)致靶基因表達(dá)沉默,產(chǎn)生相應(yīng)功能表型缺失,RNA干擾下的基因沉默是表觀遺傳學(xué)的重要內(nèi)容,人工合成的小RNA( SiRNA) 包括miRNA和SiRNA。小RNA序列較短,能指導(dǎo)Argonaute蛋白識別的靶分子并導(dǎo)致基因沉默。

已證明,組蛋白去乙酰化酶HDAC阻遏學(xué)習(xí)記憶,并在細(xì)胞內(nèi)有廣泛分布,人工合成HDACi顯然有重要的治療價值,HDAC2的結(jié)構(gòu)很接近HPAC1,盡管如此,科學(xué)家們還是合成許多類型的HDACi,上述各種類型學(xué)習(xí)記憶和突觸可塑性模型證明使用HDAC2i可促進(jìn)記憶,增強(qiáng)LTP,阻遏記憶下降。

3 組蛋白和 DNA 甲基化[20,21]

甲基化可發(fā)生在組蛋白,也可發(fā)生DNA上。盡管這二種甲基化產(chǎn)生的方式、調(diào)節(jié)機(jī)制和涉及的酶與蛋白等有所區(qū)別,但二者甲基化的結(jié)果是一致的,即他們都能激活基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá),從而促進(jìn)長記憶的形成和提高突觸可塑性。這點(diǎn)學(xué)術(shù)界的看法一致,沒有任何異議。下面將重點(diǎn)介紹組蛋白和DNA甲基化是如何形成,又如何影響基因轉(zhuǎn)錄及長記憶和突觸可塑性的?

真核細(xì)胞中,甲基化只發(fā)生在胞嘧啶第五位碳原子上,是由甲基轉(zhuǎn)移酶所催化,以S-腺苷甲硫氨酸( S-adnosylmethionine,SAM) 作為甲基供體,將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶上,DNA甲基化主要發(fā)生在Cp G雙核苷酸序列的胞嘧啶上,哺乳動物異染色質(zhì)的DNA約有80% 的CPG被甲基化,根據(jù)作用方式和反應(yīng)酶不同,DNA甲基化分為兩種: 維持甲基化( maintenance methylation) 和從頭甲基化 ( de novo methylation) ,前者與DNA復(fù)制相關(guān)聯(lián)。當(dāng)甲基化的雙鏈DNA被復(fù)制生成兩條的新的雙鏈DNA后,只有親代鏈?zhǔn)羌谆?甲基轉(zhuǎn)移酶是DNMT1,后者則是DNA上甲基化狀態(tài)的重新構(gòu)建,它不依據(jù)DNA復(fù)制在完全非甲基化的DNA堿基位點(diǎn)上引入甲基,是甲基化的建立機(jī)制。甲基轉(zhuǎn)移酶依賴于DNMT3a和DNMT3b的活性。

對基因轉(zhuǎn)錄的影響: 目前研究發(fā)現(xiàn),組蛋白精氨酸甲基化常伴隨轉(zhuǎn)錄的激活,賴氨酸殘基上的甲基化則因賴氨酸所在的位置不同而有差別,賴氨酸甲基化發(fā)生在組蛋白H3的第4,第9,第27,第36,第79( K4,K9,K27,K36,K79) 位及H4K20位上,其中,在酵母和哺乳動物細(xì)胞中H3K4和H336位點(diǎn)被甲基化可以激活轉(zhuǎn)錄,而H3K9 K27 K79和H420的賴氨酸甲基化則可抑制轉(zhuǎn)錄。

DNA甲基化對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)主要表現(xiàn)為抑制轉(zhuǎn)錄活性,一種可能的機(jī)制是由于DNA甲基化直接抑制了轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合,不能形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體,從而也就抑制了基因轉(zhuǎn)錄活性[16,18,20]。

對記憶的調(diào)節(jié)作用: Swati Gupta及其同事[21]研究了組蛋白甲基化對成年動物海馬部位記憶形成的影響,他們的研究得出如下主要結(jié)果: 恐懼記憶能觸發(fā)海馬CA1區(qū)H3K4三甲基化( 轉(zhuǎn)錄激活標(biāo)志) 和H3K9二甲基化( 轉(zhuǎn)錄抑制標(biāo)志)的變化; H3K4特異的甲基化轉(zhuǎn)移酶MⅡ缺失的小鼠出現(xiàn)長記憶形成障礙; 改變組蛋白甲基化與去乙酰化酶( HDAC) 抑制相偶聯(lián); H3K4三甲基化明顯增加兩種基因 ( Zif/268和Bdnf) 的啟動子,這一事件出現(xiàn)在記憶鞏固期間,已知這兩種基因在記憶形成和神經(jīng)可塑性中起重要作用。這些發(fā)現(xiàn)支持組蛋白甲基化在長記憶鞏固中扮演重要作用,其他許多學(xué)者也都證明DNA甲基化與記憶形成和儲存有關(guān),如甲基化CpG結(jié)合蛋白1( methyl-Cp G-binding protein1) 基因缺失出現(xiàn)空間記憶能力喪失,甲基化CpG結(jié)合蛋白2 ( methyl-Cp Gbinding protein 2) 基因缺失的突變小鼠出現(xiàn)恐懼記憶、空間記憶和物體識別記憶的障礙。

海馬DNA甲基化,對記憶形成起重要作用,但海馬的改變是短暫的,訓(xùn)練后1 d之內(nèi)便恢復(fù)到基礎(chǔ)水平,長記憶以及記憶的鞏固和儲存依賴于腦的不同區(qū)域,據(jù)信長記憶的形成和鞏固主要依賴于背側(cè)前額葉前扣帶皮層( dm DFC) ,為此探討皮層組蛋白甲基化是否能促進(jìn)長記憶的形成和鞏固十分必要。Miller等采用背景性恐懼記憶試驗(yàn)探查皮層DNA甲基化對長記憶的影響,報道認(rèn)為大鼠恐懼條件化環(huán)境中的背景記憶可維持?jǐn)?shù)月,在這期間,近期( recent) 記憶會轉(zhuǎn)變成遠(yuǎn)期( remote) 記憶,也即記憶從海馬( HPC) 轉(zhuǎn)變成依賴于dmP FC的記憶。首先,采用Me DIP即甲基化DNA免疫沉淀法測定皮層三種基因Zif/268,reln和Ca N的甲基化水平。動物試驗(yàn)則觀察訓(xùn)練后7 d的背景記憶,將動物分為背景組( C) 、休克組( S) 和背景加休克組( CS) 。結(jié)果表明,在所有組和所有測定時間點(diǎn),即早基因Zif/268均為去甲基化,說明環(huán)境刺激能廣泛地改變dm PFC Zif/268的甲基化狀態(tài),相反的,一個記憶正性調(diào)節(jié)基因Reln僅在受訓(xùn)練的動物即CS組動物訓(xùn)練后1 h內(nèi)出現(xiàn)高甲基化,隨后即回歸對照水平,訓(xùn)練后短時間內(nèi)Ca N( 一種記憶抑制基因) 的甲基化無改變,但在訓(xùn)練后1 d,這一基因出現(xiàn)持久的甲基化,隨后用BSP描繪訓(xùn)練后7 d Ca B甲基化的改變,發(fā)現(xiàn)僅CS組動物有顯著的Ca N甲基化。為了解皮層DNA甲基化是否能反映聯(lián)合學(xué)習(xí),動物在訓(xùn)練前注射NMDA受體拮抗劑MK-801,證明MK-801干擾了訓(xùn)練后7 d動物恐懼記憶的獲得( acquisition) ,也阻斷了訓(xùn)練后2 d dmP FC Ca N和Reln的高甲基化,但不影響Zif/268的甲基化,進(jìn)一步支持Ca N和Reln高甲基化是一種對聯(lián)合性環(huán)境信號的特異性反應(yīng)。Frankland等前期研究觀察了訓(xùn)練后不同時間對ACC( anterior cingulate) 恐懼記憶再現(xiàn)( retrieval) 的干擾。結(jié)果證明ACC在18 ~ 36 d( 近期記憶) 經(jīng)干擾失去記憶再現(xiàn),但不是訓(xùn)練后1 d或3 d( 近期記憶) ,從這一結(jié)果估計(jì)記憶的鞏固出現(xiàn)在訓(xùn)練后3 ~18 d,研究還證明皮層DNA甲基化可能在訓(xùn)練后1周內(nèi)出現(xiàn),該時段也是皮層留下記憶痕跡的時間,隨后的實(shí)驗(yàn)證明訓(xùn)練后立即向背側(cè)HPC( CA1) 注射NMDA受體選擇性抑制劑AVP,證明APV不但能干擾學(xué)習(xí),也能阻止訓(xùn)練后7 ddmP FC Ca N和Reln甲基化,表明一次性海馬 - 依賴性學(xué)習(xí)經(jīng)驗(yàn)就足以驅(qū)動皮層長時間、基因特異性甲基化改變,為了進(jìn)一步探討皮層DNA甲基化是否伴隨長記憶的形成,觀察了訓(xùn)練后30 d的皮層甲基化及記憶鞏固的情況,結(jié)果證明在CS動物皮層的Ca N甲基化仍十分明顯,而且與長記憶的出現(xiàn)和維持的時間段相吻合,此外還觀察到在HPC有快速甲基化,而在dm PFC有持久的甲基化,以上研究闡明了以下幾個問題: 第一,海馬HPC可啟動學(xué)習(xí)記憶,產(chǎn)出過渡性短記憶,第二,長記憶的形成和鞏固依賴于dm PFC,第三,海馬和皮層記憶的形成均緣于海馬和皮層DNA的甲基化,或甲基化與其它組蛋白修飾的協(xié)同作用,第四,重要的記憶相關(guān)基因和受體包括Zif/268,Reln,Bdnf和NMDA受體。組蛋白甲基化是如何調(diào)整認(rèn)知過程,它的生物學(xué)機(jī)制是什么?Day和Sweatt提出了闡明組蛋白甲基化是表觀遺傳學(xué)標(biāo)志的假說[20],如在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變成功能性后果,出現(xiàn)三種可能性: 第一、DNA甲基化驅(qū)使神經(jīng)細(xì)胞的反應(yīng)狀態(tài)發(fā)生了改變,即它允許、容納其它機(jī)制參與進(jìn)來產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)和維持更加長遠(yuǎn)的改變; 第二、甲基化事件積極參與和改變基因的讀出,促進(jìn)記憶的進(jìn)行,例如增加突觸強(qiáng)度和突觸可塑性; 第三、表觀遺傳學(xué)機(jī)制幫助神經(jīng)細(xì)胞無增殖( aplastic) ,在神經(jīng)元無增殖的情況下可以以穩(wěn)定突觸數(shù)量( synaptic weight) 的分布,后者是穩(wěn)定記憶的必需條件,這一假設(shè)強(qiáng)調(diào)了突觸可塑性在記憶過程中的重要性,事實(shí)上,國際上近年的研究表明老年癡呆認(rèn)知功能的衰減與老年斑、A腦內(nèi)沉積及神經(jīng)纖維纏結(jié)無明顯相關(guān),由于突觸在信息傳遞、信息加工中的重要作用,許多學(xué)者都支持突觸功能降低( 包括突觸效能下降和突觸丟失) 是造成認(rèn)知功能障礙乃至老年癡呆的主要原因,當(dāng)前治療老年癡呆和各種認(rèn)知障礙的治療方向都在尋找加強(qiáng)突觸效能,防止突觸丟失、增加突觸新生的新藥。

3. 1組蛋白磷酸化[25,26,27]組蛋白磷酸化修飾跟乙酰化和甲基化修飾一樣具有調(diào)節(jié)認(rèn)知功能的作用,這一修飾發(fā)生在組蛋白的H3、S1和S10絲氨酸殘基上,由一組蛋白激酶包括絲裂原和應(yīng)激激酶( MSKI) 和Aurora激酶家族催化完成。組蛋白磷酸化可被蛋白磷酸酶PP1和PP2a所逆轉(zhuǎn),這兩種脫磷酸化酶又可被其它分子級聯(lián)包括多巴胺和c AMP調(diào)節(jié)的磷酸蛋白32( DARPP32) 所抑制。最具特色的磷酸化標(biāo)志存在于H3第10位( H3K10) 絲氨酸上,這一修飾招募了含有HAT活性的GCN5,因而能增加鄰近組蛋白賴氨酸殘基K9和K14的乙酰化,這解釋了為什么組蛋白乙酰化和磷酸化常常同時存在。另外,H3S10磷酸化通過改變DNA和組蛋白尾部間的交互作用增加轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。

許多研究工作已揭示組蛋白的磷酸化具有調(diào)節(jié)記憶形成的作用,編碼RSK2的基因突變能產(chǎn)生低咖啡攝入綜合癥( coffin-lowry) ,有精神遲緩、精神異常等表現(xiàn)。在動物模型上的研究,背景性恐懼條件反射形成后,H3S10磷酸化和H3S10 / K14磷酸乙酰化迅速增加,但ERK抑制后可阻斷其增加。同樣的,缺失MSKI的小鼠出現(xiàn)恐懼記憶和空間記憶障礙,這一缺陷卻不因給予HDAC抑制劑所逆轉(zhuǎn),提示組蛋白磷酸化途徑與組蛋白乙酰化并行而不是位于乙酰化的下游,與此相協(xié)調(diào)的是,組蛋白磷酸化酶PPI受抑制,能改善長時程物體識別記憶和空間記憶而不影響短記憶,從這些發(fā)現(xiàn)推測: 通過抑制PPI來增加組蛋白磷酸化對治療學(xué)習(xí)記憶障礙可能是一個有明顯特色甚至是互補(bǔ)的治療策略。

除學(xué)習(xí)記憶外,H3S10磷酸化也與藥物成癮行為學(xué)反應(yīng)有關(guān)聯(lián)。可卡因可引起紋狀體H3S10磷酸化的增加,敲除MSKI的小鼠出現(xiàn)對服用可卡因行為反應(yīng)的障礙。核內(nèi)積累的DARPP-32能影響對可卡因和蔗糖獎勵的行為反應(yīng)。組蛋白磷酸化也已被證實(shí)是抗精神病和抗巴金森氏癥下游的一個重要靶標(biāo),針對表觀遺傳學(xué)這一組蛋白磷酸化修飾設(shè)計(jì)和開發(fā)有治療潛能的化合物是很有意義的。一項(xiàng)有意義的研究指出,MSKI主要存在于神經(jīng)元和紋狀體、杏仁核、海馬等腦區(qū),MSKI這一選擇性分布是治療干擾藥物成癮的一個很好的候選者。

哺乳動物細(xì)胞Aurora激酶家族成員的結(jié)構(gòu)和功能在進(jìn)化上保守,根據(jù)該家族成員在細(xì)胞內(nèi)的定位可分為3種: Aurora-A,Aurora-B和Aurora-C。Aurora-B是有絲分裂中組蛋白H3的第四位絲氨酸磷酸化所必需的激酶。組蛋白H3磷酸化主要由Aurora-B激酶控制,除MSK和Aurora外,IB激酶( nuclear,IKK) 復(fù)合物中的異構(gòu)體( IKK) 也可以調(diào)控海馬區(qū)域組蛋白的磷酸化修飾,IKK是核因子B的一種去抑制調(diào)控子,抑制IKK可以阻止背景性環(huán)境下長期記憶的再鞏固( reconsolidation)[24]。

組蛋白磷酸化促進(jìn)長記憶形成和鞏固的機(jī)制主要是磷酸基因攜帶的負(fù)電荷中和了組蛋白上的正電荷,造成組蛋白與DNA親和力的下降,使DNA容易接近轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu),激活基因轉(zhuǎn)錄,這是長記憶形成所必需的,也解釋了為什么組蛋白磷酸化不影響短記憶。

在正常生理和表觀遺傳學(xué)的生化反應(yīng)中,磷酸化使蛋白質(zhì)和基因活化,隨后的生化和生物學(xué)反應(yīng)才能繼續(xù)進(jìn)行,所以在細(xì)胞繁殖、分化、細(xì)胞存活、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)導(dǎo)和重組、細(xì)胞凋亡以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。

3. 2 其它組蛋白修飾與認(rèn)知功能[27,28,29]

組蛋白泛素修飾涉及三類催化酶: 泛素激活酶( ubiquitin activating enzyme,E1 ) ,泛素接合酶 ( ubiquitin conjugatingenzyme,E2) 和泛素連接酶 ( ubiquitin protein ligase,E3 ) 。依賴這三種酶分三步進(jìn)行泛素化修飾,第一步E1利用ATP形式存在的能量與泛素結(jié)合成高能硫酯鍵,構(gòu)成泛素 - E1偶聯(lián)物將泛素激活; 第二步,通過轉(zhuǎn)酯作用將活化的泛素轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶E2的活性半胱氨酸殘基上; 隨后,E2將活化的泛素轉(zhuǎn)移至泛素連接酶E3上,形成高能量E3 - 泛素偶聯(lián)物,最后E3可直接或間接地促使泛素轉(zhuǎn)移到特異靶蛋白上,使泛素的羧基末端與靶蛋白的賴氨酸的-氨基形成肽鏈或轉(zhuǎn)移到已與靶蛋白相連的泛素形成多聚泛素鏈,有一個去泛素酶大家族,從賴氨酸殘基上移去泛素。

組蛋白泛素化有廣泛的細(xì)胞功能,最著名的是控制轉(zhuǎn)錄的啟動和延長,泛素酶/去泛素酶與其它組蛋白修飾,特別是與組蛋白甲基化有牽連,組蛋白泛素化與神經(jīng)退性病變之間的關(guān)聯(lián)來自亨廷氏病,Huntington與泛素連接酶h PRC12存在交互作用。在多個亨廷氏病動物模型上觀察到泛素化的H2A的增加和泛素化的H2B減少,導(dǎo)致組蛋白甲基化模式的改變和基因轉(zhuǎn)錄下調(diào),故以泛素連接酶為靶標(biāo)設(shè)計(jì)藥物對亨廷氏病可能有潛在的治療價值。

多聚( ADP-核糖) 聚合酶[poly( ADP ribose) polymerases,PARPS]在與記憶行為有關(guān)的組蛋白修飾中起一定作用,PARPs可催化ADP核糖單位從NAD+轉(zhuǎn)移到組蛋白靶位點(diǎn)上,不僅可影響染色質(zhì)的局部結(jié)構(gòu),還可影響轉(zhuǎn)錄因子及染色質(zhì)重塑復(fù)合體的結(jié)合,在操作性條件反射和位置回避實(shí)驗(yàn)中均證明PARP1可增加長記憶的形成。

3. 3衰老和神經(jīng)退行性疾病的表觀遺傳學(xué)[27,28,29,30]衰老和年齡相關(guān)性神經(jīng)退行性疾病是一個非常復(fù)雜的過程,過去有大量報道衰老與神經(jīng)退行性疾病沒有太多差異,如老年癡呆出現(xiàn)各種病理改變也在衰老過程中出現(xiàn),但從未從表觀遺傳學(xué)方面去尋找原因,現(xiàn)有的研究揭示,表觀遺傳學(xué)的異常修飾是衰老和神經(jīng)退行性疾病的主要機(jī)制,其主要病理特征表現(xiàn)在兩個方面:

其一,組蛋白和基因組DNA甲基化的減少,在衰老和神經(jīng)退化性疾病中表現(xiàn)突出,如神經(jīng)細(xì)胞和基因組DNA亞甲基化( hypomethylation) 和甲基轉(zhuǎn)移酶( HAT) 活性缺失,在AD患者的病理性神經(jīng)元和基因組DNA的亞甲基化水平更低。Mastroeni等用免疫組化方法檢測了死后AD和非AD( ND) 病人眶內(nèi)皮層Ⅱ神經(jīng)元的DNA甲基化和8種甲基化維持因子的免疫反應(yīng)性,發(fā)現(xiàn)ND和AD神經(jīng)細(xì)胞核具有甲基化胞嘧啶免疫反應(yīng)陽性的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)分別為91. 7% 1. 3% 和39. 9% 3. 4% ,甲基化胞苷呈陽性的細(xì)胞數(shù)分別為91. 1% 1. 3% 和51. 8% 6. 1% ,即AD病人的兩種甲基化模式比ND病人明顯降低,DNMT,MOD2和P662均系甲基化維持因子,在ND病人神經(jīng)元呈免疫反應(yīng)陽性,而AD病人神經(jīng)元免疫呈陰性,此外,RPL26和5. 8 SrRNA也有量的減少。

其二,HDAC2表達(dá)增加,研究證明神經(jīng)退行性改變、衰老和長期應(yīng)激都能引起HDAC2表達(dá)增加,如在神經(jīng)退行性疾病和衰老時,神經(jīng)毒性因子如A,氧化應(yīng)激( H2O2) 和細(xì)胞內(nèi)D25和CDK5激活,糖皮質(zhì)激素受體( GR) 與臨近組蛋白HDAC2啟動子區(qū)的GR反應(yīng)元件( CRE) 結(jié)合,增加腦內(nèi)HDAC2水平,HDAC2優(yōu)先與學(xué)習(xí)、記憶、神經(jīng)可塑性有關(guān)的基因如BDNF結(jié)合,同時降低組蛋白乙酰化和基因的表達(dá),破壞BDNF介導(dǎo)的正性反饋系統(tǒng),從而降低神經(jīng)可塑性和記憶的形成與鞏固。

篇6

【關(guān)鍵詞】生殖技術(shù)；輔助；不育

廣義的輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）包括人工授精（artificial insemination，AI）、體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)及其衍生技術(shù)。目前，由IVF-ET及其衍生的新的輔助生殖技術(shù)形成人類生殖技術(shù)發(fā)展的新態(tài)勢。卵母細(xì)胞漿內(nèi)單注射術(shù)(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)可以幫助許多男性不育患者，甚至是無癥患者獲得生育機(jī)會；胚胎著床前遺傳學(xué)診斷技術(shù)（preimplantation genetic diagnosis，PGD）使得許多遺傳性疾病在胚胎植入前得以診斷，達(dá)到優(yōu)生的目的；冷凍胚胎和配子復(fù)蘇技術(shù)可以增加一次取卵多次移植的機(jī)會，減少移植胚胎的數(shù)目，減少多胎妊娠率；囊胚培養(yǎng)技術(shù)跨越了胚胎基因激活的階段，與子宮內(nèi)膜發(fā)育同步，種植率高；細(xì)胞核移植技術(shù)重建卵子，給卵子儲備量少而產(chǎn)生卵子數(shù)少的患者帶來了福音，但是對重構(gòu)卵的遺傳作用存在爭議；人類未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟技術(shù)（in vitro maturation，IVM）適用于卵子成熟障礙的患者，避免了促性腺藥物的副作用，創(chuàng)傷性小，減少醫(yī)患負(fù)擔(dān)。

1 體外受精-胚胎移植

19世紀(jì)末至20世紀(jì)中期，是IVF-ET的動物試驗(yàn)階段，正是這些動物實(shí)驗(yàn)奠定了人類IVF-ET成功的基礎(chǔ)。1976年，英國的Steptoe等［1］報道了人類首次IVF-ET妊娠，但不幸的是妊娠結(jié)局為異位妊娠；隨后經(jīng)過不懈的努力，于1978年獲得了Louise Brown的出生。IVF-ET是指在自然周期或刺激周期，于卵泡成熟時將卵子從卵巢中取出，在體外與共培養(yǎng)形成胚胎并移植入子宮的一項(xiàng)技術(shù)。適用于輸卵管性不育、免疫性不育、不明原因性不育等。IVF-ET治療程序包括：

1.1 控制性超排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）與監(jiān)測卵泡發(fā)育目的是誘導(dǎo)婦女產(chǎn)生同步發(fā)育的多個卵泡。COH是IVF-ET的關(guān)鍵，良好的COH方案可以獲得高質(zhì)量的成熟卵母細(xì)胞，從而提高受精率和妊娠率。近20年來，COH策略已經(jīng)發(fā)生了許多變化。這些變化涉及到藥物的使用，從克羅米芬，到人絕經(jīng)期促性腺激素（human menopause gonadotropin，HMG），再到高純度卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和基因重組FSH。在20世紀(jì)90年代初，促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a）降調(diào)節(jié)被廣泛采用。使用GnRH-a的COH方案可以避免過早的內(nèi)源性黃體生成素（luteinizing hormone，LH）峰，防止卵泡過早黃素化，提高卵子質(zhì)量，增加妊娠率。但是同時也增加了促性腺激素（gonadotropin，Gn）的用量，延長治療周期，未能有效地抑制卵巢過度刺激綜合征(ovary hyperstimulation syndrome，OHSS)的發(fā)生。近年來，GnRH拮抗劑（GnRH-A）的第三代制劑投入臨床使用，GnRH-A的作用特點(diǎn)是：①與垂體GnRH受體競爭性結(jié)合；②即時產(chǎn)生抑制效應(yīng)，降低Gn和性激素水平；③抑制效果劑量依賴性；④保留垂體反應(yīng)性［2］。由于GnRH-A的作用機(jī)制與GnRH-a存在區(qū)別，它具有GnRH-a所沒有的優(yōu)點(diǎn)，減少了Gn的用量和用藥時間，降低了OHSS的發(fā)生率及過早LH峰發(fā)生率，但是因?yàn)槿狈ψ銐虻呐R床資料驗(yàn)證，GnRH-A的安全性有待進(jìn)一步研究。生長激素（growth hormone，GH）的使用：對卵巢功能、卵泡生長、類固醇激素的分泌作用是已知的，可能直接作用于卵巢，刺激卵泡生長、卵母細(xì)胞的成熟及卵巢雌激素的產(chǎn)生［3］。故往往與Gn聯(lián)合應(yīng)用以獲得較好的超排卵反應(yīng)，增加可移植胚胎的數(shù)目。

1.2 取卵于注射人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）后的36 h左右，卵泡成熟但未破裂時，抽取卵泡液找出卵母細(xì)胞。在IVF-ET的應(yīng)用初期曾采取腹部切口或腹腔鏡進(jìn)行取卵手術(shù)，現(xiàn)在基本已被B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵所替代。

1.3 體外受精-胚胎移植將取出的卵母細(xì)胞放入培養(yǎng)液中培養(yǎng)，使卵子進(jìn)一步成熟，并與經(jīng)過處理的混合受精培養(yǎng)。鏡下觀察到受精后，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞分裂至4~8個細(xì)胞時將胚胎移植入母體子宮內(nèi)。

1.4 黃體支持應(yīng)用黃體酮或者HCG支持至妊娠3個月。IVF-ET在臨床上已經(jīng)應(yīng)用了20余年，有足夠的資料證實(shí)其安全性，Anthony等［4］對4224例IVF-ET和314605例自然受孕的先天畸形率作對比，結(jié)果無明顯差異。Hahn等［5］對IVF子代進(jìn)行調(diào)查，認(rèn)為其行為、精神神經(jīng)、運(yùn)動、社會適應(yīng)等方面與自然受孕兒無差異。

2 卵母細(xì)胞漿內(nèi)單注射術(shù)

2.1 適應(yīng)證 ICSI技術(shù)是幫助直接穿過卵母細(xì)胞而發(fā)生受精，使那些曾經(jīng)被認(rèn)為喪失生育功能的夫婦獲得自己的后代。近年來被成功應(yīng)用于男性不育癥的治療。ICSI的主要適應(yīng)證是：中前向運(yùn)動＜1×109/L；未成熟，如取自或附睪的，常規(guī)IVF反復(fù)受精失敗，不明原因不孕，卵子冷凍后受精等。

2.2 ICSI的安全性 1992年，Palermo等［6］將ICSI技術(shù)應(yīng)用于臨床并獲得成功，成為輔助生殖技術(shù)發(fā)展的里程碑。隨后相繼出現(xiàn)附睪、甚至精細(xì)胞ICSI治療技術(shù)，使得無癥不育的治療有了新的突破。ICSI技術(shù)治療的有效性是肯定的，Tourmaye［7］進(jìn)行了一項(xiàng)針對男性為中等程度的少弱癥不育夫婦的實(shí)驗(yàn)：用同一批卵子隨機(jī)采用IVF和ICSI，發(fā)現(xiàn)ICSI受精率比IVF高3.9倍。但是，因?yàn)镮CSI所使用的越過了自然受精的屏障，并且在操作中可能損傷到細(xì)胞骨架或減數(shù)分裂中的紡錘體，它的安全性受到普遍關(guān)注。Causi等［8］針對2949例ICSI和10785例IVF臨床妊娠結(jié)局分析，表明ICSI未增加妊娠失敗或出生缺陷的概率。Bonduelle等［9］也報道ICSI后出生缺陷與一般人群的發(fā)病率相似。但是，這些證據(jù)并不能否定ICSI存在一定的遺傳風(fēng)險。

2.3 ICSI潛在的風(fēng)險

2.3.1 使用遺傳異常的風(fēng)險 ①染色體異常。②囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)基因(CFTR)突變：先天性雙側(cè)輸精管缺失的不育癥患者有75%~80%至少可以檢測出一個CFTR突變［10］。③Y染色體的微缺失：Y染色體長臂的無因子（azoospermia factor，AZF）分為3個功能區(qū)：AZFa、AZFb、AZFc。其中AZFa缺失常與精原細(xì)胞完全缺失有關(guān)；AZFb缺失通常與生殖細(xì)胞成熟停滯有關(guān)；AZFc缺失較常見，與多種無和嚴(yán)重少弱癥有關(guān)。在存在AZF缺失的情況下進(jìn)行ICSI治療，會將AZF缺失遺傳給男性子代，故應(yīng)該考慮通過PGD進(jìn)行性別選擇。④雄激素受體（AR）基因三核苷酸重復(fù)：AR基因CAG片斷的重復(fù)在ICSI應(yīng)用過程中可以被遺傳甚至于被擴(kuò)增。過度擴(kuò)增的CAG重復(fù)序列增加神經(jīng)元變性疾病的發(fā)病風(fēng)險，如延髓脊髓性肌萎縮超過50%表現(xiàn)為嚴(yán)重少弱癥或無精癥導(dǎo)致不育。

2.3.2 線粒體DNA(mtDNA)遺傳風(fēng)險 mtDNA突變率較高，可以引起人類功能障礙。但目前還沒有證據(jù)表明ICSI會增加父親mtDNA傳遞導(dǎo)致mtDNA疾病的風(fēng)險［11］。

2.3.3 顯微注射過程中以及外源性物質(zhì)導(dǎo)入卵子的風(fēng)險如聚乙烯一氯五環(huán)酮（PVP）液、病原體等。

2.3.4 機(jī)械損害的風(fēng)險損傷細(xì)胞骨架或減數(shù)分裂中的紡錘體。

2.3.5 印跡基因改變的風(fēng)險 Lucifero等［12］報道ICSI技術(shù)有可能干擾卵母細(xì)胞或早期胚胎中母系基因印跡的建立和維持。故為了減少ICSI的遺傳風(fēng)險，應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的遺傳學(xué)檢測。

3 胚胎著床前遺傳學(xué)

診斷技術(shù)PGD是輔助生殖技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合發(fā)展的產(chǎn)前診斷技術(shù)。通過顯微操作獲得來自卵裂球、囊胚或者胚泡滋養(yǎng)外胚層的單細(xì)胞，應(yīng)用PCR和FISH技術(shù)進(jìn)行遺傳學(xué)診斷。PGD主要應(yīng)用于性連鎖隱性遺傳病、單基因疾病、染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)異常及與高齡相關(guān)的非整倍體檢測等，以減少畸形胎兒的發(fā)生率。1990年，Handyside等［13］報道第1例植入前性別診斷嬰兒出生。發(fā)展至今，應(yīng)用FISH技術(shù)行PGD可針對性連鎖遺傳、胚胎非整倍體的篩選、染色體結(jié)構(gòu)異常等做出診斷。Abdelhadi等［14］報道用適宜的探針與要求進(jìn)行PGD監(jiān)測染色體非整倍體的患者的活檢細(xì)胞經(jīng)歷3個連續(xù)的熒光原位雜交過程，可同時檢測13對染色體的異常。Munne［15］報道經(jīng)PGD檢測后的妊娠自發(fā)流產(chǎn)率從23%降至11%。理論上講，只要有足夠的序列信息，PGD能夠針對任何遺傳條件進(jìn)行分析，即凡是能夠被診斷的遺傳病都可以通過PGD來防止患兒出生。但是，目前PGD在技術(shù)上尚存在難點(diǎn)，其細(xì)胞遺傳學(xué)分析診斷的準(zhǔn)確率和可靠性尚難達(dá)到100%。目前，PGD取材的主要來源有三：極體、卵裂球或滋養(yǎng)層細(xì)胞的活檢以及單個或數(shù)個細(xì)胞。卵裂球活檢是目前常用的方法，這種方法的缺點(diǎn)是卵裂階段的胚胎嵌合體的發(fā)生率很高，卵裂階段單個卵裂球的檢測結(jié)果并不能代表整個胚胎的狀態(tài)，可能造成誤診或者漏診［16］。囊胚是胚胎進(jìn)行活檢的最后階段，囊胚期滋養(yǎng)細(xì)胞可以獲得充足的樣本量，提高PGD的準(zhǔn)確性。但是，胚胎必須在受精后5~6天移植，使得診斷時間受到嚴(yán)格限制。極體活檢的優(yōu)點(diǎn)是不影響卵子的正常發(fā)育與受精，而且取材較早，有更多的時間分析；缺點(diǎn)是不能分析父源性染色體異常。已經(jīng)有學(xué)者應(yīng)用極體和卵裂球胚胎聯(lián)合活檢進(jìn)行PGD，提高診斷率［17］。目前尚無足夠的資料證明PGD對子代安全性的影響，但在優(yōu)生優(yōu)育方面蘊(yùn)含著巨大的潛力。隨著人類對疾病基因認(rèn)識的深化及診斷技術(shù)的提高，將某些遺傳病從人群中篩選出來的希望仍然存在。

4 冷凍技術(shù)

在生殖領(lǐng)域中，冷凍技術(shù)應(yīng)用廣泛，包括：冷凍、胚胎凍存、成熟卵子凍存、幼稚卵細(xì)胞及卵巢組織凍存等。凍融胚胎移植的臨床意義：冷凍胚胎和配子復(fù)蘇技術(shù)可以增加一次取卵多次移植的機(jī)會，減少移植胚胎的數(shù)目，減少多胎妊娠率；在治療中出現(xiàn)嚴(yán)重的OHSS時，可以推遲移植時間；發(fā)生治療意外時，如移植困難等。凍融胚胎移植周期的妊娠率雖然低于新鮮移植周期，但累計(jì)妊娠率增加。尤其現(xiàn)在對移植胚胎的數(shù)目的限制及單胚胎移植的趨勢，使得冷凍技術(shù)有了更大的潛力。胚胎凍存可在原核期、卵裂早期和囊胚期進(jìn)行。胚胎冷凍的方法有程序冷凍、超快速凍融法和玻璃化法等。目前大多數(shù)采用玻璃化法技術(shù)。1986年，Chen［18］首次報道了人類卵子冷凍經(jīng)體外受精后獲得妊娠。卵母細(xì)胞的凍存處于排卵時，卵母細(xì)胞處于減數(shù)分裂的中期Ⅱ，含有23條染色體，每個染色體有2條染色單體組成，排列在赤道面上，與減數(shù)分裂紡錘體的微管相連，這個時期的結(jié)構(gòu)對溫度極為敏感，故卵母細(xì)胞的凍存難題至今尚未攻克。而未成熟卵母細(xì)胞具有相對靜止、體積小、缺乏透明帶及皮質(zhì)顆粒的特性，比成熟卵子更易耐受冷凍和復(fù)蘇過程中所造成的損傷。近年來，隨著IVM技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)可以采用幼稚的卵細(xì)胞甚至卵巢組織薄片凍存。

5 囊胚培養(yǎng)技術(shù)

囊胚期胚胎經(jīng)過了人類胚胎發(fā)育阻滯階段（8細(xì)胞期）的篩選，可以獲得最具有活力的胚胎進(jìn)行移植；囊胚期移植更符合生理狀況，有利于增加子宮內(nèi)膜與胚胎發(fā)育的同步性［19］；為PGD的實(shí)施提供了時間，使得胚胎在活檢后有更長的時間恢復(fù)再進(jìn)行移植［20］。囊胚期胚胎培養(yǎng)的發(fā)展經(jīng)歷了3個階段：單一培養(yǎng)、共培養(yǎng)和序貫培養(yǎng)。近年來，序貫培養(yǎng)已經(jīng)基本取代了前兩者。1998年，Gardner等［21］在哺乳類胚胎生理學(xué)基礎(chǔ)上，根據(jù)人類生殖道液糖類的含量和胚胎進(jìn)入宮腔時宮腔液的成分，設(shè)計(jì)配置了不含血清的G1、G2序貫培養(yǎng)液，新近又推出G3系列培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間可以延長至5天，使得胚胎在體外發(fā)育至囊胚期成為現(xiàn)實(shí)。囊胚移植的適宜人群尚無定論，目前臨床上將第3天8細(xì)胞胚胎數(shù)目作為決定的一個關(guān)鍵條件。第3天8細(xì)胞胚胎數(shù)＜3個在第3天移植，≥3個可繼續(xù)培養(yǎng)至第5天移植。Racowsky等［22］經(jīng)過回顧性分析發(fā)現(xiàn)，第3天8細(xì)胞胚胎數(shù)≥3者第5天移植較第3天移植的妊娠率明顯提高，第3天8細(xì)胞胚胎數(shù)＜3者第5天移植較第3天移植妊娠率無明顯差異。研究證明，選用高質(zhì)量的囊胚移植不但顯著提高胚胎著床率，還可以減少多胎妊娠發(fā)生的風(fēng)險［23］。隨著人們對胚胎發(fā)育認(rèn)識的不斷深入及實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的不斷發(fā)展，囊胚期移植的優(yōu)勢導(dǎo)致它有可能會取代現(xiàn)行的胚胎培養(yǎng)體系成為IVF治療的常規(guī)方法。

6 卵子重建

細(xì)胞核移植技術(shù)是近幾年來發(fā)展起來的新技術(shù)，為卵子的重建提供了新的方法。女性到37~38歲，卵母細(xì)胞減少的速度增快，不僅卵母細(xì)胞存儲數(shù)量減少，而且質(zhì)量也隨著年齡的增長而下降。目前沒有辦法能夠修復(fù)或挽救這些卵子。設(shè)想它的部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)能被正常卵子所替代，可提高卵子質(zhì)量。途徑之一是胞質(zhì)置換，但是這種胞質(zhì)置換發(fā)生在成熟卵子，并不能解除減數(shù)分裂過程中可能發(fā)生的染色體失衡。這一問題可通過轉(zhuǎn)移生發(fā)泡（GV）期卵子核到一去核年輕婦女的未成熟卵子內(nèi)來解決，即核移植。然后通過體外培養(yǎng)使這些卵子成熟，以排出第一極體作為核成熟的標(biāo)志。核移植技術(shù)的應(yīng)用，將會使制造卵子成為可能，給那些由于卵子儲備量少而產(chǎn)生卵子數(shù)少的患者帶來福音。但是，因?yàn)榫€粒體具備一種特性——擁有獨(dú)立于核DNA的線粒體DNA（mtDNA）、Barritt等［24］報道移植后供者的mtDNA持續(xù)存在；大部分學(xué)者對這項(xiàng)技術(shù)持謹(jǐn)慎態(tài)度：胞質(zhì)內(nèi)含有遺傳物質(zhì)，重構(gòu)卵的遺傳物質(zhì)已經(jīng)發(fā)生變化！

7 人類未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)

成熟技術(shù)自1991年Cha等［25］從因?yàn)榱夹圆∽兌磺谐穆殉仓蝎@取不成熟卵母細(xì)胞，在體外培養(yǎng)成熟并成功妊娠以來，IVM技術(shù)無論在實(shí)驗(yàn)室還是臨床方面的研究都取得了一定的進(jìn)展。2004年Chain等［26］報道世界上已有300多例采用IVM技術(shù)妊娠的嬰兒分娩。IVM技術(shù)主要是針對一些卵子成熟障礙的不育癥患者，尤其是對于多囊卵巢綜合征（PCOS）無排卵者已經(jīng)有較多的研究并獲得了較高的臨床妊娠率(25%)［27］。IVM技術(shù)是指在不經(jīng)過超促排卵或少量應(yīng)用促性腺激素后從卵巢中獲取未成熟卵，在體外經(jīng)過適宜的條件進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，使卵母細(xì)胞成熟并具有受精能力。在IVM過程中，培養(yǎng)環(huán)境對卵母細(xì)胞的成熟至關(guān)重要，在培養(yǎng)系統(tǒng)添加促性腺激素、表皮生長因子、葡萄糖和丙酮酸、卵泡液等有助于卵子成熟，另外，卵泡的直徑大小、取卵時間、年齡等因素也會影響卵母細(xì)胞的成熟。IVM盡管取得了很大的進(jìn)步，但仍然存在許多問題和不足：卵子成熟率低、成熟后卵子受精率低、種植率低、IVM卵子質(zhì)量不能保證。經(jīng)IVM妊娠分娩的子代尚缺乏足夠的臨床資料驗(yàn)證其安全性。但是，IVM具有顯而易見的臨床意義，在于：與IVF/ ICSI技術(shù)結(jié)合治療多囊卵巢綜合征即卵巢發(fā)育不良等疾病；避免患者接受超促排卵導(dǎo)致的卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生；節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用和就醫(yī)時間；解決卵巢組織冷凍保存后卵細(xì)胞的成熟問題及未成熟卵冷凍保存后的應(yīng)用問題，將會對癌癥患者在化療或者放療之前拯救其遺傳物質(zhì)，為高齡婦女建立卵母細(xì)胞庫具有重大意義；為卵母細(xì)胞成熟機(jī)制的研究建立體外模式。由此可見，IVM技術(shù)的研究對治療人類不育、推動輔助生殖技術(shù)的發(fā)展有著深遠(yuǎn)的影響。經(jīng)過近20年的發(fā)展，我國的輔助生殖技術(shù)已經(jīng)取得了驚人的進(jìn)步，許多新技術(shù)對不育癥的治療產(chǎn)生了很大的作用。在掌握社會和醫(yī)學(xué)倫理以及本領(lǐng)域相關(guān)規(guī)范的保障下，相信輔助生殖技術(shù)會得到健康可持續(xù)發(fā)展。

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篇7

關(guān)鍵詞：基因組編輯；CRISPR-Cas9；豬；基因功能；網(wǎng)絡(luò)調(diào)控

中圖分類號：R34；S828 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6510-07

最新的CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）分類表將其描述為三大類型和多個亞型，結(jié)合生物化學(xué)與分子遺傳學(xué)方法揭示了不同CRISPR-Cas（CRISPR associated protein）類型的特征[1]，其中II型系統(tǒng)Cas9比其他更為簡便。基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的作用原理，研究人員模擬細(xì)菌的成熟crRNA和tracrRNA，在體外人工合成gRNA（guide RNA），同樣可以達(dá)到特異地切割靶標(biāo)DNA，從而將該系統(tǒng)簡化成核酸酶Cas9和人工合成的sgRNA兩個組分，在靶標(biāo)位點(diǎn)導(dǎo)致所期望的插入、刪除或替換，由此開創(chuàng)了新型基因編輯技術(shù)，這是該系統(tǒng)的“基因工程功能”。更進(jìn)一步地，通過點(diǎn)突變得到缺乏核酸酶活性的Cas9突變體，命名為dCas9。突變的dCas9可在gRNA的引導(dǎo)下，實(shí)現(xiàn)與DNA結(jié)合，但不能切割DNA。而dCas9具有融合異源模塊的結(jié)構(gòu)域，利用dCas9這3點(diǎn)特性，將其與一系列具有功能的異源模塊融合，實(shí)現(xiàn)不同研究目的：轉(zhuǎn)錄激活與抑制、探索未知基因及其調(diào)控元件的功能、全基因組掃描等，這是該系統(tǒng)的“基因調(diào)控功能”。不論是基因工程/基因調(diào)控，其工作過程是相同的：gRNA通過序列互補(bǔ)原則將核酸酶帶到基因組特定位點(diǎn)，使其與靶標(biāo)結(jié)合。不過，基因工程與基因調(diào)控是利用Cas9蛋白的不同形式，包括野生型Cas9與人工突變的dCas9蛋白，以實(shí)現(xiàn)各自目的[2，3]。該技術(shù)能夠快速地構(gòu)建遺傳改造的動物，使得在過去要花費(fèi)數(shù)月或數(shù)年的工作現(xiàn)在只需幾周完成。CRISPR技術(shù)與PCR技術(shù)類似，正在給生物工程研究帶來革命性的改變，從各個方面影響著生命科學(xué)的發(fā)展[4]。目前基因組編輯CRISPR-Cas中也主要是應(yīng)用Cas9系統(tǒng)，下面簡稱“Cas9系統(tǒng)”。

2013年初以來，Cas9系統(tǒng)的快速創(chuàng)新及其拓展應(yīng)用，使其成為可替代ZFN和TALEN的第三代基因組編輯工具。2013年Science雜志將Cas9系統(tǒng)選為年度十大突破之一（亞軍）；2014年美國加州大學(xué)伯克利分校生物化學(xué)家Doudna博士和德國的Charpentier博士因此共同獲得了美國硅谷“科技突破獎”與“阿爾珀特獎”；2015年被Science雜志評選為年度十大突破之首；2016年具有小諾貝爾獎之稱的蓋爾德納國際獎授予了三位科學(xué)家：Doudna，Charpentier和麻省理工學(xué)院的張鋒三位博士。幾大公司看好Cas9系統(tǒng)的成果商業(yè)化前景。Editas Medicine、Intellia Therapeutics和CRISPR Therapeutics等公司已經(jīng)收到數(shù)億美元的投資。例如，2015年比爾?蓋茨等大佬宣布為促進(jìn)基因編輯技術(shù)的蓬勃發(fā)展，共投資1.2億美元參與基因編輯公司 Editas Medicine的B輪融資，Cas9先驅(qū)之一張鋒是該公司的聯(lián)合創(chuàng)始人。Editas Medicine計(jì)劃于2017年采用基因編輯療法對先天性黑蒙癥進(jìn)行臨床試驗(yàn)，這是一種罕見的視網(wǎng)膜疾病，基因突變可能導(dǎo)致眼睛中的感光細(xì)胞逐漸消失。據(jù)麻省理工W院Broad研究所網(wǎng)站最新報道，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)巨頭杜邦（DuPont）公司宣布對Caribou Sciences公司進(jìn)行投資，且將獲得其專利在農(nóng)作物使用的獨(dú)家授權(quán)。而Caribou Sciences是Cas9技術(shù)首創(chuàng)之一Doudna博士實(shí)驗(yàn)室的附屬公司。目前，杜邦公司正在溫室中種植Cas9編輯的玉米、大豆、水稻和小麥，期望在5～10年內(nèi)出售Cas9技術(shù)的產(chǎn)品。位于明尼蘇達(dá)州圣保羅的動物生物科技公司Recombinetics正在開發(fā)同類動物，包括無須抑制牛角生長的牛和不需要被的豬。2016年6月底，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）顧問委員會批準(zhǔn)了一項(xiàng)申請：利用Cas9系統(tǒng)強(qiáng)化依賴于患者T細(xì)胞（一種免疫細(xì)胞）的癌癥療法。由于其易用性和通用性，Cas9已經(jīng)被世界各地的實(shí)驗(yàn)室用來改寫基因組和重塑細(xì)胞，其在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用是無窮無盡的，它將開啟該行業(yè)新一波的產(chǎn)品浪潮和利益追逐。根據(jù)瑞士洛桑附近的咨詢機(jī)構(gòu)IPStudies介紹，全球已有超過860項(xiàng)CRISPR專利，平均每天新增加一項(xiàng)專利。世界許多遺傳學(xué)家和生化學(xué)家普遍認(rèn)為，Cas9系統(tǒng)可對所有的生物進(jìn)行改造，這是一項(xiàng)可改變生命未來的偉大技術(shù)，當(dāng)然，該技術(shù)也面臨許多倫理挑戰(zhàn)。

1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的拓展性應(yīng)用研究

最初的Cas9只能實(shí)現(xiàn)剪切的基因工程功能（CRISPR1.0版本）。每次只能執(zhí)行一種功能的dCas9是CRISPR2.0。現(xiàn)在研究人員將突變dCas9蛋白與一系列具有功能的異源模塊融合，成為能夠執(zhí)行多重功能的CRISPR3.0。這種平臺能夠執(zhí)行復(fù)雜的程序，適用于研究基因網(wǎng)絡(luò)機(jī)理和更深入探討復(fù)雜性狀/疾病[5]。

1.1 同時激活多基因表達(dá)/同時抑制多基因

Chavez等[2]設(shè)計(jì)了三方轉(zhuǎn)錄激活子（VP64-p65-Rta）融入dCas9，可探討一連串基因回路對生物過程（比如組織發(fā)育或疾病發(fā)生）的影響，也可以精確指導(dǎo)干細(xì)胞分化，生成再生醫(yī)學(xué)所需的移植器官。Konermann等[6]應(yīng)用改造后的Cas9系統(tǒng)成功激活了十個基因，包括長非編碼RNA（LncRNA）。這些基因轉(zhuǎn)錄效率得到了兩倍以上的增長，該研究的意義在于，人們可以用這一技術(shù)在活細(xì)胞中有效啟動任何基因表達(dá)[7]。Cas9系統(tǒng)已被成功地用于同時干擾小鼠2個基因和敲除猴與蠶的兩個基因[8，9]。多位點(diǎn)編輯將促進(jìn)多方面研究，包括上位效應(yīng)的檢測和基因組中物理距離非常接近的多基因操作。Ma等[10]同時靶向基因家族的多成員（多至8個位點(diǎn)），突變率平均為85.4%。Zalatan等[11]應(yīng)用架RNA（scaffold RNA，scRNA），成功在酵母中重新定向了一個復(fù)雜的多分支的代謝通路，其中一些基因被激活，另一些基因被抑制（CRISPRa/i）。多基因的組合控制可以幫助人們靈活操縱細(xì)胞中的通路，例如，改寫細(xì)胞命運(yùn)或者設(shè)計(jì)代謝通路。Cheng等[5] 報道其CRISPR 3.0版本是Casilio，該系統(tǒng)可結(jié)合多個蛋白模塊，包括基因激活、基因抑制、染色體熒光標(biāo)記、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶等，以實(shí)現(xiàn)不同的目的。

1.2 運(yùn)用Cas9實(shí)施表觀遺傳學(xué)編輯

Kearns等[12]報道dCas9-組蛋白脫甲基酶LSD1 在鼠胚胎干細(xì)胞中靶向轉(zhuǎn)錄因子Oct4的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子，抑制Oct4轉(zhuǎn)錄并失去多能性。許多酶能以不同的機(jī)制催化DNA去甲基化，其中，TET（Ten-Eleven Translocation dioxygenase）雙加氧酶家族有3個成員：TET1、TET2和TET3，催化的5-甲基胞嘧啶氧化，可啟動DNA的去甲基化。Xu等[13]首先向傳統(tǒng)sgRNAs中插入兩個拷貝的噬菌體MS2 RNA元件，構(gòu)建了修飾后的sgRNA2.0，這有利于Tet1催化結(jié)構(gòu)域（TET-CD），與dCas9或MS2外殼蛋白融合，以靶向基因位點(diǎn)。結(jié)果證明，dCas9/sgRNA2.0指導(dǎo)的去甲基化系統(tǒng)能有效地將靶基因去甲基化，可顯著上調(diào)靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括RANKL、MAGEB2或MMP2，而且這結(jié)果與它們啟動子中相鄰的CpG島的DNA去甲基化密切相關(guān)。類似的工作與結(jié)果也由Choudhury等[14]報道于模式抑癌基因BRCA1啟動子。這些結(jié)果不僅可以幫助我們理解在特定背景中DNA甲基化如何調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制，而且也使我們能夠控制基因表達(dá)與功能，并帶來潛在的臨床效益。表觀遺傳效應(yīng)模塊的匯總詳見文獻(xiàn)[15]。

1.3 運(yùn)用Cas9開展高通量全基因組遺傳學(xué)篩選

全基因組 CRISPR 篩選克服了傳統(tǒng)遺傳篩選的缺點(diǎn)，可應(yīng)用于幾乎任何細(xì)胞系和任何遺傳背景下的篩選[16]。應(yīng)用其進(jìn)行遺傳篩選的基礎(chǔ)是蛋白Cas9修飾后的多種形式融合和sgRNA文庫。構(gòu)建Cas9高通量篩選的文庫有兩種：陣列文庫和混合文庫。（1）細(xì)胞系中開展遺傳學(xué)篩選。Wong等[17]創(chuàng)建了Cas9與CombiGEM結(jié)合的平臺技術(shù)，可展望，該平臺有著廣泛的應(yīng)用前景，加速系統(tǒng)鑒定控制人類疾病表型的遺傳組合，并轉(zhuǎn)化到新藥物組合的發(fā)現(xiàn)。（2）體內(nèi)開展遺傳學(xué)篩選。Ma等[18]將活化誘導(dǎo)胞嘧啶核苷脫氨酶（AID）與dCas9融合成為dCas9-AIDx，在慢性粒細(xì)胞中靶標(biāo)BCR-ABL，鑒定了賦予細(xì)胞伊馬替尼抗性的已知突變和新突變。Zhu等[19]開發(fā)了配對的gRNAs（pgRNAs），產(chǎn)生大片段缺失，應(yīng)用這種高通量方法確定了51條功能性的lncRNAs，并驗(yàn)證了其中的9個。該方法使科學(xué)家們能夠快速識別哺乳動物非編碼元件的功能。

1.4 光遺傳學(xué)加CRISPR調(diào)控基因表達(dá)與靶DNA切割

東京大學(xué)和杜克大學(xué)基于光誘導(dǎo)的CRY2（色素）和CIB1（蛋白），開發(fā)出相似的光遺傳學(xué)+CRISPR系統(tǒng)，其目的是利用光來開啟和關(guān)閉基因表達(dá)，同時賦予時空控制和可逆性[20-22]。

1.5 通過熒光標(biāo)記的dCas9對DNA實(shí)施標(biāo)記

Deng等[23]w外構(gòu)建“dCas9/熒光素”復(fù)合物作為探針，可視化基因組位點(diǎn)完全沒有引起DNA變性，稱為Cas9介導(dǎo)的熒光原位雜交（CASFISH）。dCas9/sgRNA能夠在近著絲粒區(qū)、著絲粒、G富集端粒和編碼基因等位點(diǎn)快速而有效地進(jìn)行重復(fù)DNA元件標(biāo)記，也適用于初生組織切片的檢測。這種技術(shù)具有快速、有效、破壞性較少與成本低的特征，為基礎(chǔ)研究和遺傳學(xué)診斷增加了一種非常有潛力的工具。

1.6 CRISPR-Cas9系統(tǒng)同時實(shí)現(xiàn)基因工程和基因調(diào)控的雙重功能

Kiani等[24]開發(fā)了Cas9系統(tǒng)一個新策略，能夠同時實(shí)現(xiàn)基因組工程和基因調(diào)控的雙重功能。其使用經(jīng)過改造的gRNA和Cas9蛋白，在切割特定基因的同時調(diào)控其他基因的表達(dá)。這一技術(shù)大大增強(qiáng)了基因組編輯和基因調(diào)控的功能性，幫助我們進(jìn)一步操縱細(xì)胞，以揭示重要生命過程背后的復(fù)雜機(jī)理，比如，癌癥耐藥性和干細(xì)胞分化，或者幫我們設(shè)計(jì)更高級的人工基因回路。更進(jìn)一步地，雙重功能Cas9可以促進(jìn)基因工程菌株（例如大腸桿菌）大規(guī)模生產(chǎn)化合物和燃料。

1.7 多順反子基因

Xie等[25]將tRNA與gRNA結(jié)合起來，開發(fā)合成了一個多順反子基因，以提高Cas9系統(tǒng)的靶向能力和多重編輯效率，能夠在水稻中高效實(shí)現(xiàn)多重基因組編輯和染色體片段刪除（可達(dá)到100%）。Qi等[26]設(shè)計(jì)多個tRNA-gRNA單元，在玉米中的研究表明，該系統(tǒng)不僅增加靶向位點(diǎn)數(shù)目，也能更有效和準(zhǔn)確地缺失染色體片段，這對基因功能的完全消除特別是lncRNAs的研究很重要。同時還表明，在一個表達(dá)盒中可容納多達(dá)四個tRNA-gRNA單元，用來修飾同一基因家族中的不同成員或同一代謝途徑中的不同調(diào)控基因。

1.8 Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于多能干細(xì)胞

誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）可無限地自我更新，而不會喪失分化成所有細(xì)胞類型的能力，且繞過了免疫排斥的障礙。iPSCs在再生醫(yī)學(xué)中具有良好的前景，是用于致病突變原位校正的一種理想細(xì)胞群。將CRISPR應(yīng)用到iPSCs中為糾正遺傳缺陷疾病開辟了一條新途徑，因?yàn)閕PSCs很難采用傳統(tǒng)的基因打靶策略進(jìn)行操作，尤其是蛋白質(zhì)介導(dǎo)的基因組編輯方法[27-30]。

1.9 染色體大片段和lncRNA編輯

Shechner等[31]介紹了以CRISPR-Cas9為基礎(chǔ)的基因組靶向技術(shù)展示：CRISPR-Display（CRISP-Disp），將gRNA-ncRNA融合，能將大片段非編碼RNA帶到特定DNA位點(diǎn)，同時不影響dCas9的功能。CRISP-Disp系統(tǒng)可容納約4.8 kb的RNA結(jié)構(gòu)域，這相當(dāng)于天然lncRNA的長度。除了lncRNA以外，研究人員還對各種天然和人工非編碼RNA進(jìn)行了測試，表明gRNA可以偶聯(lián)多個非編碼RNA結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域可同時且獨(dú)立起作用。CRISP-Disp可用來解決如下問題：一個lncRN段是如何調(diào)控基因表達(dá)的？是這個片段的轉(zhuǎn)錄本在起作用，還是它本身的序列在起作用？揭示lncRNA在表觀遺傳學(xué)修飾、染色質(zhì)重塑或者轉(zhuǎn)錄調(diào)控中做出的貢獻(xiàn)。該系統(tǒng)除了研究非編碼RNA機(jī)理外，對合成生物學(xué)來說，CRISP-Disp的靈活性、模塊化和多重化特性是很有吸引力的。用CRISP-Disp招募RNA-蛋白復(fù)合體到特定位點(diǎn)，可以設(shè)計(jì)出復(fù)雜的基因調(diào)控回路。Yoshimi等[32]開發(fā)出了兩種基因改造新技術(shù)：lsODN（long single-stranded oligodeoxynucleotide）和2H2OP（Two-hit two-oligo with plasmid）），來完成相對較長的DN段，如GFP（Green fluorescent protein）序列的靶向基因敲入，提高基因編輯的效率。第一種方法是利用lsODNs作為靶向供體。第二種方法是共同注射兩個gRNAs作為“剪刀”切割基因組DNA和供體質(zhì)粒DNA中的靶位點(diǎn)，兩個短ssODNs作為“漿糊”連接切割位點(diǎn)的末端。利用開發(fā)出的兩種基因改造方法，該研究小組成功實(shí)現(xiàn)了高效、精確敲入GFP基因，導(dǎo)入了近200 kb的大片段基因組區(qū)域，這是采取傳統(tǒng)方法不可能做到的。并用人源基因替代了大鼠基因，構(gòu)建出了基因人源化的動物。這兩種基因敲入方法將會提高遺傳工程改造的效率。研究人員高度期待這些遺傳工程生物將用于藥物研發(fā)、轉(zhuǎn)化和再生醫(yī)學(xué)等廣泛的研究領(lǐng)域。

1.10 研究蛋白質(zhì)工程

Hess等[33]開發(fā)了一種稱為重利用體細(xì)胞超突變的原位蛋白質(zhì)工程新技術(shù)，命名為CRISPR-X。研究人員利用dCas9召集胞嘧啶氨酶（AID）變異體，其攜帶有經(jīng)過MS2修飾的sgRNAs，能特異地誘變內(nèi)源靶標(biāo)，限制脫靶傷害。它能產(chǎn)生不同點(diǎn)突變的多樣文庫，同時靶向多個基因組位點(diǎn)，結(jié)果從中找到了引發(fā)Bortezomib耐藥性的已知和新突變。還利用超活化AID變異體，同時誘變了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游和下游的位點(diǎn)。這些結(jié)果均表明 CRISPR-X是一種強(qiáng)大的工具，能幫助科學(xué)家們創(chuàng)建復(fù)雜的原始遺傳突變文庫，分析完善蛋白質(zhì)工程。

2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)在豬中的研究進(jìn)展

Cas9系統(tǒng)出現(xiàn)之前，已經(jīng)有文獻(xiàn)報道了其他技術(shù)的基因組編輯豬[34]，現(xiàn)在利用Cas9系統(tǒng)的報道層出不窮。這里重點(diǎn)綜述Cas9系統(tǒng)在豬研究中的進(jìn)展，因?yàn)樨i不僅提供肉食，同時其在生理學(xué)、免疫學(xué)和基因組學(xué)上與人高度相似，器官大小也比嚙齒動物有優(yōu)勢。

2.1 功能基因研究

Su等[35]合成sgRNA時用豬U6啟動子代替人U6啟動子，獲得更佳的打靶效率；Wang等[36]顯微注射Cas9 mRNA和sgRNA至豬原核期胚胎，篩選出打靶效率最高的sgRNA；He等[37]將攜帶GFP和紅色熒光蛋白（RFP）的Cas9質(zhì)粒先后轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，通過雙重?zé)晒夂Y選提高打靶成功效率；吳金青等[38]應(yīng)用SSA（Single-strand annealing）報告載體，使Cas9系統(tǒng)對豬胎兒成纖維細(xì)胞的打靶效率提高5倍左右。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（OCT4）是參與調(diào)控胚胎干細(xì)胞自我更新和維持其全能性的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。Kwon等[39]研究表明Cas9系統(tǒng)可針對孤雌胚胎實(shí)現(xiàn)基因OCT4的敲除和敲入。Lai等[40]構(gòu)建了一個豬OCT4的報告系統(tǒng)，其內(nèi)源性O(shè)CT4啟動子可直接控制RFP，因此熒光能準(zhǔn)確地顯示內(nèi)源性O(shè)CT4的激活，并獲得了在內(nèi)源性O(shè)CT4基因啟動子下游具有tdTomato基因敲入的豬胎兒成纖維細(xì)胞（PFF）系。Cas9系統(tǒng)編輯的PFFs被用作體細(xì)胞核移植（SCNT）的供體細(xì)胞，在SCNT胎兒的囊胚和生殖嵴中檢測到了強(qiáng)大的RFP表達(dá)，并制備了兩頭有生命力的基因編輯豬。

2.2 提高生產(chǎn)性能

肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）基因?qū)∪馍L發(fā)育具有重要調(diào)控作用。Crispo等[41]、Cyranoski[42]、Wang等[43]和張冬杰等[44]利用Cas9系統(tǒng)獲得了MSTN基因的雙等位基因敲除豬。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所Bi等[45]應(yīng)用Cas9系統(tǒng)制備了無選擇標(biāo)記的MSTN基因敲除克隆豬。首先，利用Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的同源重組敲除豬初生細(xì)胞中MSTN的一個等位基因。然后，用Cre重組酶來切除選擇標(biāo)記基因，有效率為82.7%。免疫印跡顯示，克隆豬MSTN大約有50%的降低，同時肌原性基因在肌肉中的表達(dá)有所增加。組織學(xué)顯示，肌纖維數(shù)量增加，但是肌纖維大小保持不變。超聲波檢測顯示，最長肌大小增加，背部脂肪厚度降低。該研究提供了一種可靠的途徑用于家畜良種生產(chǎn)，也提出了一種策略來減少潛在的生物學(xué)風(fēng)險。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所的李奎教授領(lǐng)導(dǎo)研究團(tuán)隊(duì)，首次利用Cas9系統(tǒng)獲得了位點(diǎn)特異性的基因敲入豬模型[46]，得到一個新的基因組“安全港”位點(diǎn)：pH11位點(diǎn)，通過Cas9系統(tǒng)分別在細(xì)胞、胚胎和動物體內(nèi)的該位點(diǎn)插入了大于9 kb的基因片段，實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定高效的基因表達(dá)。

分化簇 163（Cluster of differentiation 163，CD163）被認(rèn)為是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的受體基因，分化簇1D（CD1D）是一類抗原遞呈因子。Whitworth等[47]利用Cas9系統(tǒng)分別敲除CD163和CD1D的基因編輯豬；經(jīng)過藍(lán)耳病毒株攻毒后CD163雙等位基因敲除豬未表現(xiàn)出臨床癥狀，具有良好的抗藍(lán)耳病能力。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所利用Cas9系統(tǒng)進(jìn)行抗PRRSV和抗豬傳染性胃腸炎（PEDV）的CD163和CD13雙基因編輯豬的制備，正在開展相關(guān)驗(yàn)證鑒定工作。這些研究在養(yǎng)豬業(yè)引起了高度關(guān)注。

2.3 研究人類疾病的動物模型

豬是人類醫(yī)學(xué)研究極佳的動物模型。vWF（von Willebrand factor）的基因是引起人血管性血友病的主因。Hai等[48]應(yīng)用Cas9系統(tǒng)靶向豬vWF外顯子，目的基因插入/缺失突變效率達(dá)到 68.8%（11/16）；單等位基因突變和雙等位基因突變的vWF抗原水平均極顯著低于野生型個體（P

再如，去除所有主要淋巴細(xì)胞的豬是研究人X-染色體連鎖的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）患者病毒感染和免疫受損發(fā)病機(jī)理的理想動物模型。破壞IL2RG的豬比嚙齒動物敲除IL2RG模型更接近于SCID表型。Lei等[50]利用Cas9系統(tǒng)快速生成雙基因RAG2/IL2RG敲除豬，成功建立了人諾如病毒（HuNoV）感染的免疫缺陷的豬模型，因?yàn)镽AG2/IL2RG缺陷豬缺乏B細(xì)胞、T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。Yu等[51]成功地通過Cas9系統(tǒng)在滇南小型豬產(chǎn)生人類DMD疾病動物模型。

2.4 醫(yī)學(xué)生物反應(yīng)器

豬除了作為人類疾病模型外，也可作為生產(chǎn)人類需要的產(chǎn)品反應(yīng)器。例如，賴良學(xué)課題組利用精確Cas9系統(tǒng)對豬胰島素基因進(jìn)行了無痕定點(diǎn)修飾，3頭可以分泌人胰島素的克隆豬，其中2頭完全分泌人胰島素，而不含豬胰島素；另一頭既分泌人胰島素也分泌豬胰島素。牛泌乳量大、乳汁活性蛋白的產(chǎn)量高，因此其乳腺是理想的生物反應(yīng)器，Peng等[52]通過CRISPR技術(shù)建立了人血清白蛋白的生物生產(chǎn)器。人成纖維細(xì)胞生長因子2（hFGF2）是一種多功能生長因子，在促進(jìn)組織生長發(fā)育、新血管形成和參與組織修復(fù)過程中起著重要的作用，但其在人體內(nèi)的表達(dá)量較低。Jeong等[53]借助Cas9系統(tǒng)將該基因?qū)氲脚３衫w維細(xì)胞的β-casein基因內(nèi)含子中，為獲得表達(dá)hFGF2蛋白的基因編輯牛奠定了基礎(chǔ)。谷氨酸棒桿菌是工程化應(yīng)用傳統(tǒng)方法（同源重組）批量生產(chǎn)氨基酸的重要生物機(jī)體。Cleto等[54]采用CRISPRi降低該菌的基因PGI和PCK的表達(dá)高達(dá)98%，降低基因PYK高達(dá)97%，從而大大增強(qiáng)了L-賴氨酸和L-谷氨酸產(chǎn)品滴度的比率。這種新谷氨酸代謝工程方法只需要3 d時間，表明CRISPRi可用于快速且有效地代謝途徑改造，而不需要對基因缺失或突變。

2.5 異種器官移植

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界大概有200萬人需要器官移植，而器官捐獻(xiàn)的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于需求數(shù)量[55]。尤其是老齡化和慢性疾病的多發(fā)，更加導(dǎo)致供體器官嚴(yán)重不足。豬被認(rèn)為是人體異種器官來源的首選動物，因?yàn)樨i與其他哺乳動物比較，無論從器官大小、生理結(jié)構(gòu)和基因組相似度都更接近于人，因此，上世紀(jì)90年代應(yīng)用豬生產(chǎn)人類器官項(xiàng)目一度在全球受到追捧，但受阻于豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Porcine endogenous retrovi-ruses，PERVs）造成的重大醫(yī)療風(fēng)險。哈佛大學(xué)利用Cas9系統(tǒng)對豬腎細(xì)胞系PK15中所有62個拷貝的PERV pol（多聚酶）基因敲除，使內(nèi)源性病毒傳遞給人的風(fēng)險降低了1 000倍以上[56]。該研究掃除了豬器官用于人體移植的安全障礙，為全世界亟需器官移植的上百萬病人帶來希望，也重新燃起了大家對異種器官移植的信心。

免疫排斥反應(yīng)是豬器官移植另一障礙。α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（GGTA1）基因與異種器官移植后的超急性免疫排斥反應(yīng)顯著相關(guān)，Sato等[57]在豬胎兒成纖維細(xì)胞中通過Cas9系統(tǒng)獲得了GGTA1雙等位基因敲除的細(xì)胞系。Li等[58]針對3個與免疫排斥相關(guān)的基因GGTA1、胞苷單磷酸N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶（CMAH）和異紅細(xì)胞糖苷酯合成酶（iGb3S）基因，共轉(zhuǎn)染靶向這2個或3個基因的CRISPR/Cas9-PX330構(gòu)質(zhì)粒，最終獲得了敲除單個基因及同時敲除2個或3個基因的胎兒或仔豬。利用類似的方法，Estrada等[59]對豬肝臟細(xì)胞分別敲除GGTA1、GGTA1/CMAH和GGTA1/CMAH/β4GalNT2（β-1， 4-N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶2）基因。

3 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的前景

CRISPR-Cas9系統(tǒng)在如此短的時間內(nèi)極大地推動了生物學(xué)的各個方面研究，例如基因功能解析、基因治療、人類疾病動物模型、生物生產(chǎn)反應(yīng)器和農(nóng)業(yè)動植物優(yōu)質(zhì)遺傳育種。該技術(shù)生成的產(chǎn)品，定向改變但不含外源基因/片段，在驗(yàn)證其安全性的基礎(chǔ)上，這種經(jīng)過“基因組編輯”的產(chǎn)品更容易被消費(fèi)者接受。理論上它不會帶來健康或環(huán)境方面的風(fēng)險，但是否應(yīng)該受到轉(zhuǎn)基因相關(guān)法律的約束，美國和歐盟的態(tài)度不一致。作為新興的基因組編輯技術(shù)，有必要進(jìn)一步完善其特異性、脫靶效應(yīng)和輸送方法，以及如何更好地激活細(xì)胞自身的同源重組，并探索新型基因組編輯技術(shù)及其應(yīng)用，例如，新CRISPR-Cpfl系統(tǒng)[60]、新型NgAgo系統(tǒng)[61]；無序列限制的DNA編輯新工具[62]、納米顆粒技術(shù)[63]等等。

r業(yè)動植物改良從來都是一個漫長而繁瑣的過程，而如今，科學(xué)家因?yàn)橛辛薈RISPR技術(shù)能夠快速而輕松地實(shí)現(xiàn)。近兩年，許多實(shí)驗(yàn)室將這種工具應(yīng)用在動植物和微生物中，以期獲得更高產(chǎn)、更適應(yīng)環(huán)境和更優(yōu)質(zhì)的品種。有理由相信，CRISPR-Cas9系統(tǒng)將更好的服務(wù)于人類，包括動植物育種。

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篇8

一、微生物培養(yǎng)中的篩選問題

對于微生物來說，不同的微生物需要不同的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基就是根據(jù)不同微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。從物理性質(zhì)來講，常用固體培養(yǎng)基通過平板劃線分離法或稀釋涂布分離法進(jìn)行分離篩選目的菌種，如在以尿素為唯一氮源的固體培養(yǎng)基中，采用稀釋涂布分離法可篩選出以尿素為唯一氮源的微生物；從目的用途上講，常用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選目的菌種。選擇培養(yǎng)基就是在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的微生物生長，以獲得人們所需的微生物。如培養(yǎng)基中缺乏碳源可篩選出自養(yǎng)型微生物，培養(yǎng)基中缺乏氮源可篩選出自生固氮菌，培養(yǎng)基中加入高濃度食鹽可篩選出金黃色葡萄球菌。利用微生物進(jìn)行現(xiàn)酵生產(chǎn)，其首要任務(wù)就是通過上述方法從自然界中分離篩選出符合生產(chǎn)要求的單一優(yōu)良野生菌種，然后再經(jīng)過誘變育種、基因工程或細(xì)胞工程獲得優(yōu)良菌種。

二、基因工程中的篩選問題

基因工程的核心步驟是形成重組DNA，即用同一種限制酶處理目的基因和質(zhì)粒，使其露出相同的粘性末端，然后在適量的DNA連接酶作用下，形成一個封閉式的環(huán)狀DNA。這些環(huán)狀DNA有兩種是由一個DN段形成的，即目的基因環(huán)狀物和質(zhì)粒環(huán)狀物；有三種是由兩個DN段形成的，即質(zhì)粒自連的環(huán)狀物（即普通質(zhì)粒）、目的基因自連的環(huán)狀物、質(zhì)粒與目的基因相連的環(huán)狀物（即重組質(zhì)粒或重組DNA）。

如何從這五種環(huán)狀物中篩選出重組質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入到受體細(xì)胞呢？首先要選擇質(zhì)粒，選擇的質(zhì)粒應(yīng)具備兩種或兩種以上抗生素抗性基因，如圖1所示。然后將目的基因插入到其中的一個抗生素抗性基因，如將目的基因插入到四環(huán)素抗性基因（Tetr），導(dǎo)致Tetr結(jié)構(gòu)破壞而無法表達(dá)。

在進(jìn)行導(dǎo)入操作時，普通質(zhì)粒和重組質(zhì)粒都可能導(dǎo)入受體細(xì)胞，而目的基因自連的環(huán)狀物無法導(dǎo)入，因此在導(dǎo)入操作后存在三種受體細(xì)胞的混合物：多數(shù)沒有導(dǎo)入任何質(zhì)粒的受體細(xì)胞（普通受體細(xì)胞）、很少導(dǎo)入普通質(zhì)粒的受體細(xì)胞（不含目的基因）和導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞（獲得目的基因）。

第一次篩選：將含有三種受體細(xì)胞的混合物接種到含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，普通受體細(xì)胞不含氨芐青霉素抗性基因（Ampr）無法生存，而導(dǎo)入普通質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞都具有Ampr，所以都能生存和增殖，長成菌落。從而篩選出導(dǎo)入普通質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞。

第二次篩選：采用影印接種法，即用一小塊滅菌的絲絨固定在直徑較平板略小的圓柱形木塊上，構(gòu)成印章（即接種工具，圖2和圖3A所示）；然后把前述經(jīng)過第一次篩選長出菌落的母平板倒置在絲絨的印章上，輕輕印一下（圖3B）；再把此印章在另一個含四環(huán)素抗性基因的選擇培養(yǎng)基（圖3D）的平板上印一下。這樣，由于重組質(zhì)粒的Tetr被目的基因破壞，不能形成菌落的即為含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞，根據(jù)對比（如圖3C和3D所示），就能在母平板的培養(yǎng)基上篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞。

三、細(xì)胞工程中的篩選問題

1. 植物體細(xì)胞雜交

在植物體細(xì)胞雜交過程中，將A和B兩細(xì)胞去細(xì)胞壁后人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合形成融合體（AB），還有未融合體（A、B）、多元融合體（AA、BB）和嵌合體。但只有AB型細(xì)胞是植物體細(xì)胞雜交所需的雜種細(xì)胞。因此在雜種細(xì)胞形成后還應(yīng)有一個篩選過程。篩選的方法有：（1）突變細(xì)胞系互補(bǔ)選擇法：包括葉綠體缺失互補(bǔ)、營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)、抗性互補(bǔ)和遺傳互補(bǔ)等，前兩種為隱性性狀，其實(shí)施的關(guān)鍵是作為遺傳標(biāo)記的有關(guān)突變體的利用。遺傳互補(bǔ)是一種很好的篩選方法，即兩個突變的細(xì)胞融合后才能正常生長，但由于受到突變體不易獲得的限制，且有些突變體不易再生，該法應(yīng)用并不廣泛；（2）物理特異性差異選擇法：利用兩個原生質(zhì)體親本的物理特異性差異的選擇，例如根據(jù)愈傷組織的顏色、熒光特性等在顯微鏡下機(jī)械分離雜種細(xì)胞。當(dāng)以熒光特性作為依據(jù)時，可采用流式細(xì)胞光度儀來分離雜種細(xì)胞，該法不但準(zhǔn)確、效率高，而且用熒光化合物標(biāo)記原生質(zhì)體并不影響細(xì)胞再生植株的能力，但價格昂貴；（3）生長特異性差異選擇法：根據(jù)兩種原生質(zhì)體親本的生長特異性（如形態(tài)、色澤）來選擇；（4）不對稱融合法：不對稱融合指一方親本的全部原生質(zhì)體與另一方親本的部分核物質(zhì)及胞質(zhì)重組，產(chǎn)生不對稱雜種。一般用碘乙酰胺處理受體使其酶失活，單獨(dú)培養(yǎng)不能生長和分裂；而供體由于受到射線輻射，大部分染色體受到損傷，細(xì)胞不能生長；只有融合體發(fā)生互補(bǔ)作用才能生長，從而篩選出雜種細(xì)胞。

融合后的原生質(zhì)體，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，可以再生出新的細(xì)胞壁，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞分裂及分化，形成再生植株。獲得再生植株后，還必須對其進(jìn)行嚴(yán)格的鑒定，可以從基因組DNA和基因表達(dá)兩方面來進(jìn)一步確認(rèn)。前者主要是利用各種已知的分子標(biāo)記如限制性片段長度多態(tài)性、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA、簡單重復(fù)序列、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性等進(jìn)行雜種鑒定，后者主要是通過同工酶、次生代謝產(chǎn)物的分析來確定雜種植株。例如Austin等通過對再生植株蘋果酸脫氫酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶等酶的同工酶進(jìn)行分析獲得了雜種植株。此外，形態(tài)學(xué)（植株表現(xiàn)型）及細(xì)胞學(xué)（染色體的形態(tài)和數(shù)目）的觀察和比較也是常用手段。

2. 單克隆抗體的制備

在單克隆抗體的制備過程中，首先用相應(yīng)抗原刺激小鼠，當(dāng)從小鼠脾臟中分離出能產(chǎn)生抗體的效應(yīng)B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合時，將會形成多種細(xì)胞的混合體，包括B淋巴細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、B－B融合細(xì)胞、骨髓瘤－骨髓瘤融合細(xì)胞、B－骨髓瘤融合細(xì)胞（即雜交瘤細(xì)胞）和細(xì)胞多聚體（容易死亡，無需篩選），如何從混合細(xì)胞中提取到雜交瘤細(xì)胞呢？

第一次篩選：目的是獲得代謝缺陷型骨髓瘤細(xì)胞。通過突變誘導(dǎo)次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細(xì)胞，并經(jīng)過毒性培養(yǎng)基篩選出的HGPRT-或TK-骨髓瘤細(xì)胞。具體方法是將誘導(dǎo)突變的骨髓瘤細(xì)胞放入含氮鳥嘌呤或6－硫代鳥嘌呤的培養(yǎng)基上，含HGPRT的骨髓瘤細(xì)胞會將氮鳥嘌呤或6－硫代鳥嘌呤轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的核苷酸形式參與DNA合成而發(fā)生毒性作用，使細(xì)胞致死。而HGPRT-骨髓瘤細(xì)胞由于HGPRT活性喪失，不能使用含氮鳥嘌呤或6－硫代鳥嘌呤，能生活在高濃度的含氮鳥嘌呤或6－硫代鳥嘌呤的培養(yǎng)基上。同理，在培養(yǎng)基中加入5－溴尿嘧啶脫氧核苷（BudR），可篩選出TK-骨髓瘤細(xì)胞。

第二次篩選（圖4中A過程）：目的是從5種細(xì)胞中篩選出雜交瘤細(xì)胞（用HAT選擇培養(yǎng)基）。HAT選擇培養(yǎng)基是在普通培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物質(zhì)配制而成。而細(xì)胞的DNA合成途徑有兩條：主要合成途徑（D途徑）是由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，葉酸作為輔酶參與，而氨基蝶呤是葉酸的抑制物，可阻斷細(xì)胞合成DNA。輔助途徑（S途徑）可直接利用外源核苷酸合成DNA，在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸存在情況下，經(jīng)次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用下合成DNA。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞和融合的骨髓瘤－骨髓瘤細(xì)胞由于培養(yǎng)基中氨基蝶呤存在無法利用D途徑合成DNA；又因缺乏HGPRT或TK，不能利用S途徑合成DNA而死亡。未融合的B淋巴細(xì)胞和融合的B-B淋巴細(xì)胞雖具有HGPRT和TK，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有雜交瘤細(xì)胞從B淋巴細(xì)胞獲得了HGPRT和TK，并具有骨髓瘤細(xì)胞無限增殖的特性，所以能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖，從而最終篩選出雜交瘤細(xì)胞。

第三次篩選（圖4中B過程）：目的是獲得產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。在實(shí)際免疫中，由于實(shí)驗(yàn)小鼠在注射目標(biāo)抗原前，其體內(nèi)已有大量病原體，會存在大量的針對不同類型抗原的效應(yīng)B細(xì)胞，因此不同的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體也不同。目前從雜交瘤細(xì)胞群中篩選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞最常用的方法是有限稀釋法，將處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用培養(yǎng)液充分稀釋后，接種在多孔的細(xì)胞培養(yǎng)板上，使每一孔含一個雜交瘤細(xì)胞，再由這些單細(xì)胞克隆生長，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)形成群落到覆蓋10%～20%孔底時，吸取培養(yǎng)液的上清液用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法（ELISA）測定，其原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在聚苯乙烯等固相載體上的可溶性抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)。利用上述方法可篩選出針對目標(biāo)抗原的抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞，并使其擴(kuò)大培養(yǎng)或冷凍保存。

四、胚胎工程中的篩選問題

篇9

關(guān)鍵詞：肝炎病毒，乙型；基因；變異(遺傳學(xué))

乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)的基因組由長度為3200個堿基對、部分雙鏈的環(huán)狀DNA分子構(gòu)成，含有4個部分重疊的開放讀碼框架(OpenReadingFrame，ORF)，即SORF、CORF、PORF和XORF。HBV的聚合酶(Polymease，Pol)/逆轉(zhuǎn)錄酶(ReverseTranscriptase，RT)缺乏糾錯功能，允許復(fù)制錯誤發(fā)生。復(fù)制錯誤將導(dǎo)致多種不同的HBV準(zhǔn)種的出現(xiàn)。

1、SORF變異

HBVDNA的SORF包括前-S1區(qū)、前-S2區(qū)(兩者合稱前-S區(qū))和S區(qū)，編碼產(chǎn)物最基本的功能是構(gòu)成HBVDane顆粒的包膜蛋白。目前的研究認(rèn)為，SORF編碼的大蛋白具有反式激活功能，與HBV的復(fù)制密切相關(guān)，而且血清大蛋白的檢測對評估慢性乙型肝炎患者的病毒感染狀況和隱匿性HBV感染患者的檢出具有重要意義[1-2]。

前-S1區(qū)和前-S2區(qū)與P基因的空白區(qū)重疊，這兩個區(qū)域都具有B細(xì)胞和T細(xì)胞的識別位點(diǎn)。一些前-S1區(qū)的變異可以導(dǎo)致被截斷的大蛋白在胞漿內(nèi)的積聚，這會抑制病毒的分泌并具有細(xì)胞毒效應(yīng)。但是，Gao等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在有的肝癌患者體內(nèi)，大蛋白完全缺失的HBV也可以成為優(yōu)勢種群，他們認(rèn)為，是患者體內(nèi)的野生型前-S蛋白修復(fù)了這種缺陷，即體內(nèi)的野生株HBV幫助了這種缺陷病毒株，確保了其在體內(nèi)的存活。前-S2區(qū)變異包括前-S2ATG的缺失或錯配，引起蛋白合成終止以及B細(xì)胞和T細(xì)胞表位的缺失或改變。前-S變異經(jīng)常出現(xiàn)在應(yīng)用干擾素治療的患者中[4]。前-S區(qū)的缺失變異會影響大蛋白對小蛋白的比例，導(dǎo)致與肝病惡化相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力過大，進(jìn)而引發(fā)大蛋白或中蛋白與宿主染色體整合，增加了肝細(xì)胞癌變的可能[5]。Mun等[6]研究發(fā)現(xiàn)，前-S區(qū)缺失的頻率隨肝臟疾病的臨床嚴(yán)重程度逐漸增加，但前-S1和前-S2的缺失頻率是有差別的，前-S1缺失在肝細(xì)胞癌患者中發(fā)生率最高，而前-S2缺失在肝硬化患者中發(fā)生率最高。

S區(qū)點(diǎn)變異可導(dǎo)致逃逸變異株的出現(xiàn)，變異通常發(fā)生在HBsAga抗原決定簇區(qū)域，目前報道較多的變異形式多為sG145R[7]。此外，基因分析表明，sP120A變異與HBsAg血清抗體轉(zhuǎn)換有關(guān)，這種變異降低了抗-HBs的結(jié)合作用，使HBsAg的檢測失敗[8]。文獻(xiàn)報道，有10個S基因變異與疫苗免疫逃逸相關(guān)，分別是sP120T、sI/T126N/A、sQ129H、sM133L、sK141E、sP142S、sD144A、sG145R、sF158Y和sF161Y[9]，但這些變異的臨床意義還有待進(jìn)一步研究。

2、CORF與XORF變異

HBVDNA的CORF包括前核心區(qū)和核心區(qū)，有各自的翻譯起始密碼子ATG，分別編碼前核心蛋白和核心蛋白。

前核心蛋白經(jīng)過修飾最終形成可溶性抗原HBeAg。核心啟動子變異和前核心變異均會影響HBeAg的表達(dá)。HBVDNA的XORF編碼HBx蛋白。HBx蛋白是一種多功能病毒蛋白，具反式激活作用。

在從HBeAg-/抗-HBe+的患者體內(nèi)分離到的病毒株中，A1762T和G1764A雙重變異是最常見的BCP變異形式。

這種變異會引起HBx蛋白結(jié)構(gòu)中兩個氨基酸的變化進(jìn)而影響HBx蛋白的活性以及改變病毒增強(qiáng)子的反轉(zhuǎn)錄作用[10]，與肝細(xì)胞癌的發(fā)生關(guān)系密切[11]。Fang等[12]通過3年的縱向病例分析得出，A1762T和G1764A雙重變異與HBeAg+患者體內(nèi)較低的病毒載量有關(guān)，但對HBeAg-患者體內(nèi)的病毒載量沒有影響。T1766/A1768變異與暴發(fā)性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。Ren等[13]的研究表明，慢加急性肝衰竭(無肝硬化基礎(chǔ))的患者與慢性乙型肝炎患者相比，A1762T/G1764A檢出率顯著增高。

前核心變異株則通過干擾前核心讀碼框架而完全終止HBeAg的表達(dá)，有時還伴隨著起始密碼子錯配變異和前核心區(qū)的框架移位變異。最常見的前核心變異是前核心區(qū)28位密碼子(Codon28)由TGG變?yōu)門AG(G1896A)。核心區(qū)發(fā)生變異會終止HBeAg的表達(dá)，引起HBeAg陰性肝炎。由于HBeAg與HBcAg有共同的抗原決定簇，缺少HBeAg有可能使表達(dá)HBcAg的肝細(xì)胞更容易受到免疫細(xì)胞的攻擊，臨床上表現(xiàn)為HBeAg陰性肝炎病情容易出現(xiàn)反復(fù)，發(fā)生暴發(fā)性肝炎(肝衰竭)的幾率增高。有研究發(fā)現(xiàn)，慢加急性肝衰竭患者的G1896A變異率顯著高于慢性乙型肝炎患者[13]。

A1762T/G1764A和G1896A檢測有助于區(qū)分臨床上慢性乙型肝炎急性發(fā)作和急性乙型肝炎[14]。

與以上研究相反，有研究者認(rèn)為，核心啟動子變異和前核心變異不會引起肝臟功能失代償，而是對肝臟功能失代償起保護(hù)性的影響，HBV基因型與肝臟功能失代償也沒有明顯的關(guān)系[15]。Poustchi等[16]通過研究認(rèn)為，在慢性乙型肝炎D基因型患者中，BCPA1762T和G1764A雙重變異與肝臟疾病惡化相關(guān)，而G1757A變異卻對宿主有一定的保護(hù)作用。

核心區(qū)編碼基因相對保守，其編碼的核心蛋白是宿主免疫反應(yīng)攻擊的主要靶抗原，它的變異可直接影響到宿主對HBV的免疫應(yīng)答。有研究顯示，核心區(qū)變異株(G87、V60)與野生株比較，前者可使宿主細(xì)胞內(nèi)HLA-ⅠmRNA及其蛋白的表達(dá)水平降低[17]。Sugiyama等[18]研究認(rèn)為，核心區(qū)A2339G(codon147)變異在體外會增強(qiáng)HBV的復(fù)制；而且發(fā)生此變異的患有慢性乙型肝炎的兒童和沒有此變異的患有慢性乙型肝炎的兒童相比，在血清HBeAg抗體轉(zhuǎn)換之前，前者的ALT峰值較高。

3、PORF變異

從HBVDNAPORF的N-末端到C-末端，共涉及4個功能區(qū)，即末端蛋白區(qū)、間隔區(qū)、Pol/RT區(qū)、核糖核酸酶H區(qū)。RT區(qū)又包括7個功能亞區(qū)，從RT區(qū)上游第1個氨基酸起依次為A、B、C、D、E、F、G亞區(qū)。當(dāng)前所有耐核苷(酸)類藥物的基因變異位點(diǎn)都位于RT區(qū)。

拉米夫定為胞嘧啶左旋核苷類似物，其耐藥變異位于RT區(qū)C亞區(qū)的YMDD基因序列，最常見的變異為rtM204I/V/S，而A亞區(qū)L80I變異以及B亞區(qū)rtV173L變異和rtL180M變異為其補(bǔ)償突變，以維持病毒的復(fù)制力[19]。文獻(xiàn)報道，拉米夫定也可誘導(dǎo)B亞區(qū)rtA181T/S變異[20]。替比夫定為胸腺嘧啶左旋核苷類似物，與LAM均為左旋核苷類藥物，分子結(jié)構(gòu)和作用目標(biāo)位點(diǎn)相似，因此二者存在交叉耐藥，常見變異為rtM204I。阿德福韋酯為無環(huán)腺苷類似物，RT區(qū)D亞區(qū)rtN236T變異與B亞區(qū)rtA181V變異是ADV的常見耐藥變異形式。有文獻(xiàn)將rtA181T變異也歸為阿德福韋耐藥變異，但還尚存爭論[20]。恩替卡韋為鳥嘌呤核苷類似物，其耐藥特點(diǎn)是發(fā)生在拉米夫定耐藥的背景上，耐藥位點(diǎn)是在LAM耐藥位點(diǎn)基礎(chǔ)上另加B亞區(qū)T184、S202和/或M250變異。

此外，在未應(yīng)用過核苷(酸)類藥物治療的慢性乙型肝炎患者中，YMDD基因序列變異的發(fā)生率從1%-27%不等[21]。

因此，有必要在應(yīng)用核苷(酸)類藥物治療前對患者進(jìn)行HBV耐藥變異檢測[22]。

4、小結(jié)

HBV是一種高變異的嗜肝DNA病毒。HBV基因變異可以在宿主自身免疫應(yīng)答、病毒復(fù)制適應(yīng)性等內(nèi)因的影響下發(fā)生，也可以發(fā)生于核苷(酸)類藥物或疫苗接種等外因作用之后。HBV變異是影響其感染發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的重要因素。HBV基因變異常常引起病毒生物學(xué)特性的改變，在引發(fā)疾病的臨床表現(xiàn)、診斷、預(yù)后和預(yù)防等方面帶來很多新的問題。

5、參考文獻(xiàn)

篇10

7月11日下午5點(diǎn)左右，愛爾蘭都柏林的物理學(xué)家尚恩·伯爾金及其同事捕捉到了科學(xué)史上最激動人心的一滴液滴滴落—瀝青。這個實(shí)驗(yàn)開始于1944年，目的是為了展現(xiàn)瀝青的高黏度和低流動性。澳大利亞布里斯班昆士蘭大學(xué)更是早在1927年就開始進(jìn)行這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，目前已滴下8滴瀝青，遺憾的是一次都沒有拍到。

植入記憶或成真

美國麻省理工學(xué)院腦與認(rèn)知科學(xué)系利根川進(jìn)教授的研究團(tuán)隊(duì)7月25日宣布，他們已成功給小鼠的大腦植入虛假記憶，從實(shí)驗(yàn)上證實(shí)了人為改造記憶的可能性。研究者通過光遺傳學(xué)手段標(biāo)記并激活與一個特定記憶相關(guān)的腦細(xì)胞，從而人為激活某個記憶過程。下一步，這個研究團(tuán)隊(duì)計(jì)劃通過選擇性地標(biāo)記并關(guān)閉與某一個記憶有關(guān)的腦細(xì)胞，研究是否可弱化甚至抹除記憶。

實(shí)驗(yàn)室牛肉就要走上餐桌？

8月5日，澳大利亞和美國的兩位美食家在倫敦受邀試吃了一個實(shí)驗(yàn)室培育的牛肉漢堡。這種牛肉由荷蘭馬斯特里赫特大學(xué)教授馬克·珀斯特領(lǐng)銜的實(shí)驗(yàn)室培育，利用牛肉肌肉干細(xì)胞創(chuàng)造出了更多的肉類纖維。兩位美食作家品嘗完漢堡后評價道：有肉味，但質(zhì)地比較干，味道也有些淡而無味。不過馬克·珀斯特認(rèn)為，該項(xiàng)目將為畜牧業(yè)找到一種可持續(xù)的替代行業(yè)。

最大病毒被發(fā)現(xiàn)

法國埃克斯-馬賽大學(xué)的研究者在智利沿海和澳大利亞一處池塘發(fā)現(xiàn)了一種巨大的病毒，該種病毒有1微米（百萬分之一米）大，是一般病毒尺寸的10倍。而且，它的基因與地球上其他生物的基因的相似度僅為6%。科學(xué)家認(rèn)為它起源于一種已滅亡的古老的細(xì)胞形態(tài)，甚至有可能來自外星球。雖然這種病毒的個子很大，不過研究者認(rèn)為，它只存在于水下，應(yīng)該不會對人類構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

光速為零

光速每秒30萬公里，但德國達(dá)姆施塔特工業(yè)大學(xué)物理學(xué)教授哈夫曼、胡布利克與博士生海恩斯讓光停了下來。他們利用“電磁感應(yīng)透明”效應(yīng)技術(shù)，讓光停留在水晶里長達(dá)60秒，打破了今年年初剛創(chuàng)造的16秒的世界紀(jì)錄。這項(xiàng)研究也為專家把光加速到超越宇宙限制提供了線索，也許有一天人類可以把數(shù)據(jù)存在光里傳到很遠(yuǎn)的地方。

木衛(wèi)二或適合人類居住

火星上是否有生命跡象的探索尚未得出結(jié)論，美國科學(xué)家又將目標(biāo)鎖定到木星的衛(wèi)星木衛(wèi)二身上。加州理工學(xué)院的天文學(xué)家邁克·布朗教授和美國航天局噴氣推進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的凱文·漢德共同編寫的報告認(rèn)為，木衛(wèi)二海洋的構(gòu)成可能與地球海洋非常接近，這對生命存在的可能性非常重要。而美國宇航局已經(jīng)委派一個科學(xué)家小組考慮發(fā)射航天器在木衛(wèi)二著陸后的具體目標(biāo)。

如果孩子也可以“定制”

一個叫做康納·列維的健康男嬰近日在媒體曝光，他于5月18日出生在美國賓夕法尼亞州，是世界上首例基因篩查試管嬰兒。列維的父母曾將胚胎細(xì)胞寄給了牛津大學(xué)的醫(yī)學(xué)專家，后者對細(xì)胞進(jìn)行了基因篩查，以查看是否存在染色體異常或缺失。根據(jù)篩查結(jié)果，美國的醫(yī)生將染色體正常的胚胎移入母親的子宮中，這名男嬰因而誕生。這項(xiàng)技術(shù)的初衷是為了盡可能減少懷孕失敗的概率，但是基因篩查技術(shù)的成熟和成本的下降，更多符合父母預(yù)期的“定制嬰兒”或?qū)⒊霈F(xiàn)。

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缺失的遺傳學(xué)效應(yīng)范文

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篇8

篇9

篇10

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