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1材料與儀器

1．1藥品與試劑

考馬斯亮藍G－250(北京百諾威生物科技有限公司);尿素;PMSF(北京百諾威生物科技有限公司);牛血清白蛋白(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司);乙醇;磷酸;異丙醇;去離子水。

1．2主要儀器

WFJ－2000紫外分光光度計(尤尼柯儀器有限公司);高速臺式離心機(Sigma公司);LGJ－12冷凍干燥機(北京松源華興科技發展有限公司);膠體磨，DHG－9123A電熱鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司);電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)。

2方法與結果

2．1樣品制備

鹿茸鮮品:取－80℃冷凍保存的鮮鹿茸，液氮保護下低溫粉碎成細粉。鮮品去血:取－80℃冷凍保存的鮮鹿茸，切成小塊后室溫融化，用去離子水洗去血水，然后抽干水分，液氮保護下低溫粉碎成細粉。直接凍干品:取－80℃冷凍保存的鮮鹿茸，直接用小型凍干機凍干，然后在液氮保護下低溫粉碎成細粉。鹿茸勻漿品:取－80℃冷凍保存的鮮鹿茸，液氮保護下低溫粉碎成細粉，然后加入2倍量去離子水混勻后膠體磨勻漿5min，收集勻漿液。凍干品(加凍干保護劑):取鹿茸勻漿品，加入10%凍干保護劑海藻糖，攪拌溶解，分裝于片劑模具中進行冷凍干燥，制備凍干加保護劑鹿茸樣品，成品見插頁Ⅲ圖1。凍干品(未加凍干保護劑):取鹿茸勻漿品，直接分裝于片劑模具中進行冷凍干燥，制備凍干未加保護劑鹿茸樣品凍干品(加凍干保護劑)40℃10天:取凍干品(加凍干保護劑)放入烘箱，40℃保存10天。制備凍干品(加凍干保護劑)40℃10天樣品。煮炸茸:取－80℃冷凍保存的鮮鹿茸，按傳統煮炸工藝用沸水煮炸4～5次，60～80s/次，待血從鹿茸另一側完全滲出后取出60～70℃烘干8h，冷卻后液氮保護下低溫粉碎成細粉。

2．2供試品溶液的制備

取上述樣品，按1∶5的比例分別加入含8M尿素和1mMPMSF的裂解液，冰上裂解30min，期間每10min震蕩一次，然后4℃，15000r/min離心45min，取上清液備用。

2．3考馬斯亮藍

G－250染色液的制備稱取100mg考馬斯亮藍G－250，溶于50mL乙醇中，加入85%磷酸100mL，最后用蒸餾水定容至1000mL。

2．4方法學考察

2．4．1標準曲線繪制

分別精密量取12．5、15、17．5、20、22．5μL濃度為5mg•mL－1的BSA溶液，加裂解液定容至100μL，搖勻，制備濃度分別為0．625、0．75、0．875、1、1．125mg•mL－1的BSA對照品溶液。分別加入考馬斯亮藍G－250染色液5mL進行染色，在595nm波長下測定吸光度。以溶液濃度(X)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標作線性回歸，得回歸方程為A=0．4828x+0．0046，r2=0.9988。

2．4．2顯色穩定性實驗

精密稱取鹿茸勻漿樣品，依法制備供試品溶液。每隔一定時間測定一次吸光度值，結果表明10min～2h內樣品溶液吸光度值無明顯變化，RSD值小于2%，說明10min～2h內顯色穩定性良好，結果見圖3。

2．4．3重現性實驗

精密稱取鹿茸勻漿樣品5份，依法制備供試品溶液，測定蛋白質含量，計算RSD值小于3，表明方法的重現性良好。

3討論

Bradford比色法是依據考馬斯亮藍G－250染料能與蛋白質結合的特點建立的。考馬斯亮藍G－250染色液在游離狀態下呈紅色，當它與蛋白質結合后變成深藍色，并且其蛋白質含量與染料結合量成正比，該顏色在波長595nm有一個最大吸收峰，通過比色法可測知蛋白質含量。本法最突出的特點是操作極為快速、簡單，重復性良好。本實驗的研究結果表明，不同加工工藝的鹿茸中蛋白質含量由大到小的順序依次是鹿茸鮮品(a)＞直接凍干(d)＞勻漿鹿茸(e)＞凍干未加保護劑(g)＞凍干加保護劑40℃10天(h)＞凍干加保護劑(f)＞鮮品去血鹿茸(b)＞煮炸鹿茸(c)。經秩和檢驗統計分析，其它各組的蛋白質含量均顯著低于鹿茸鮮品組(P≤0．05)。說明鹿茸加工過程中的凍干、粉碎、勻漿、加熱等工藝均會影響鹿茸中蛋白質的含量。與煮炸鹿茸相比，其它各組的蛋白質含量均顯著提高(P≤0．05)。這與鹿茸傳統煮炸工藝中的高溫加熱與去血操作有關。高溫加熱極易破壞鹿茸中的活性蛋白質成分，而鹿血中含有大量的蛋白類成分，上述操作致使煮炸鹿茸(c)在所有鹿茸制品中蛋白質含量最低。與傳統煮炸工藝相比，凍干工藝在低溫下進行，有利于保持鹿茸中蛋白類成分的含量和活性。

鹿茸凍干品是由－80℃冷凍保存的鮮鹿茸勻漿后凍干制備的，與鮮鹿茸直接凍干和鮮鹿茸勻漿相比，工藝過程更為復雜。從蛋白質含量上看，鹿茸勻漿組顯著低于鹿茸直接凍干組(P≤0．05);鹿茸凍干品組顯著低于鹿茸勻漿組和鹿茸直接凍干組(P≤0．05)。說明鹿茸的加工工藝步驟越多，工藝越復雜，對活性蛋白質成分的破壞作用越大。但鹿茸凍干品可以在常溫下長時間貯存，能夠直接服用，無需在使用前進行粉碎、加熱等二次加工，與鮮鹿茸勻漿和鮮鹿茸直接凍干品相比有其自身優勢。為進一步提高鹿茸凍干品中蛋白質成分的穩定性，還需通過凍干保護劑種類和用量，以及凍干工藝參數的優選來改善。

作者:靳夢亞董玲戴俊東魏寶霞朱美玲侯成波莫美隗麗單位:北京中醫藥大學