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【關鍵詞】再生障礙性貧血

再生障礙性貧血(aplasticanemia,AA)是血液系統常見疾病，傳統的治療方法效果欠佳，臨床死亡率高。因此，對AA發病機制的研究以及尋找有效的治療藥物具有重要的理論和實踐意義。目前對于AA，國內多采用中西醫結合治療。當歸是著名常用中藥，具有養血活血作用［1］，過去多用于治療腰腿痛和婦科疾病，隨著臨床研究的進展，其應用范圍逐漸擴大。作為補血中藥，其在血液系統疾病中的應用及研究也日漸增多。至目前為止，有關當歸在血液系統的藥理作用基本歸納為：①抑制血小板聚集及抗血栓形成；②刺激骨髓造血；③促進免疫功能恢復；④抗輻射損傷等。武漢大學人民醫院兒科從1991年起將當歸注射液用于臨床治療AA，取得較好的療效［2］。但該藥治療AA的實驗研究卻少有報道。

本實驗用當歸注射液對免疫誘導AA小鼠進行干預治療，觀察其對AA小鼠體重、外周血白細胞計數、骨髓單個核細胞計數、骨髓微環境等的影響，并從分子水平研究其作用機制，進一步為臨床應用該藥治療AA提供實驗依據。

1材料與方法

11材料

111動物雌性Balb/c小鼠(H2a、MLSb)8~12周齡，17~20g，由武漢生物制品研究所提供。DBA/2小鼠(H2a、MLSa)8~10周齡，雌雄不拘，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。

112藥品、試劑及來源25%當歸注射液由武漢大學中南醫院藥劑科提供，批號：0303131，每毫升含當歸生藥0.25g。大鼠抗小鼠CD49dRPE單克隆抗體、CD49eFITC單克隆抗體、羊抗大鼠IgGFITC熒光抗體、大鼠抗小鼠細胞周期蛋白D2單克隆抗體、溴化丙啶(PI)、RnaseA、Triton100均購自深圳晶美公司。Ficoll干粉、人淋巴細胞分離液購自美國Sigma公司。

113試劑配制

(1)0.01mol/L磷酸生理鹽水(phosphatebuffersaline,PBS)的配制：

磷酸氫二鈉(Na2HPO4)：3.48g；氯化鉀(KCl)：0.2g；磷酸二氫鉀(KH2PO4)：0.2g；氯化鈉(NaCl)：8.0g。加入1L雙蒸水稀釋后濾紙過濾，消毒，4℃冰箱保存待用。

(2)小鼠淋巴細胞分離液的配制：

Ficoll干粉2.1g加入20ml雙蒸水，配成10.5%溶液，過濾待用，用人淋巴細胞分離液100ml加入配制好的10.5%Ficoll溶液7ml，配成小鼠淋巴細胞分離液。過濾消毒，4℃冰箱避光保存待用。

(3)臺盼藍的配制：

4%臺盼藍母液：取4g臺盼藍溶入100mlPBS中，過濾消毒，4℃冰箱保存待用。工作濃度為0.4%。

114主要儀器(1)AIRTECH超凈工作臺：江蘇安泰空氣凈化技術公司生產；(2)網格測微器：購自上海森雄公司；(3)博賽酶標儀。

12動物模型的制備與分組

121免疫誘導再生障礙性貧血小鼠模型的建立參照姚軍等［3］方法，取DBA/2小鼠，斷頸處死，常規75%酒精消毒，無菌取出胸腺及頸部、頜下、腋窩、腹股溝、腸系膜等處淋巴結，加少量生理鹽水，輕輕磨碎，過濾后用1ml注射器抽取，并將此液沿管壁緩慢加入裝有配制好的小鼠淋巴細胞分離液的試管中，置水平離心機離心，轉速2000轉/分，20分鐘后取出，可見淋巴細胞懸液在中間層，用無菌吸管將淋巴細胞懸液吸出后，用PBS沖洗二遍，離心機離心，1500轉/分，5分鐘，棄上清，配成單細胞懸液，臺盼藍鑒定細胞活性，活性細胞達98%。計數后配成所需濃度備用。雌性Balb/c小鼠，經60Co6Gyγ-射線亞致死量全身照射(空氣量7.39Gy，距離80cm，時間6.87min)。4小時內由尾靜脈輸入取自DBA/2小鼠胸腺、淋巴結混合細胞，細胞量為每只1×106/0.2ml。

122分組與處理制模后小鼠分為4組，分別為模型對照組、當歸注射液小劑量組、當歸注射液大劑量組、丙酸睪丸酮組，每組8只，另設8只同批正常未經任何處理Balb/c小鼠為正常對照組。①正常對照組：予無菌生理鹽水10ml/kg.d腹腔注射，連續12天。②模型對照組：于制模當天腹腔注射無菌生理鹽水10ml/kg.d，連續12天。③、④當歸注射液小劑量組、當歸注射液大劑量組：分別于制模當天給予當歸注射液注射液2ml/kg.d及10ml/kg.d腹腔注射。⑤丙酸睪丸酮組：于制模當天腹腔注射丙酸睪丸酮10mg/kg.d。所有小鼠均給予每升含紅霉素250mg及慶大霉素320萬U的無菌水喂養。

13檢測的指標及方法

131體重變化、外周血白細胞和骨髓單個核細胞計數于制模第12天小鼠稱重后，經尾靜脈采血，按常規方法行外周血白細胞計數后，斷頸處死，取右側股骨，用PBS沖出骨髓細胞，計數，即為1根股骨中的骨髓單個核細胞(mononucleatecells,MNC)。

132尺骨骨髓切片組織學觀察取尺骨固定，塑料包埋切片，HGE染色，采用浦權等［4］的方法，于高倍鏡下用網格測微器進行骨髓造血組織容量百分率的測定，測其全片骨髓造血組織所占面積(不含骨小梁)的百分比，并觀察微血管和脂肪細胞。

造血組織面積(%)=各網格造血組織面積(%)之總和/測計全片骨髓的網格總數

133骨髓超微結構樣本制備取尺骨中段，固定于4%戊二醛溶液中，經磷酸緩沖液充分沖洗后再固定于1%四氧化鋨中，丙酮逐級脫水，環氧樹脂618包埋，超薄切片，硝酸鈷和醋酸鈉雙重染色，置于透射電鏡下觀察骨髓造血細胞和基質細胞變化。

134骨髓單個核細胞懸液il3的檢測制模后第12天斷頸處死小鼠，制備MNC懸液，調濃度為1×107/ml，培養72小時后收集上清液，采用雙抗體夾心ABCELISA法測IL3量。

14統計分析

數據以±s表示，均數比較采用t檢驗，P<0.05表示差別有顯著性。

2實驗結果

21小鼠體重、外周血白細胞及骨髓單個核細胞計數改變

實驗各組小鼠體重、外周血白細胞及骨髓單個核細胞計數均明顯低于正常對照組(P<0.01)，但當歸注射液大劑量組及丙酸睪丸酮組較模型對照組明顯增加(P<0.01)，且當歸注射液大劑量組與丙酸睪丸酮組比較無顯著差異，而當歸注射液小劑量組與模型對照組比較無顯著差異。見表1。表1當歸注射液對免疫誘導再生障礙性貧血小鼠體重、外周血白細胞及骨髓單個核細胞計數的影響注：與正常對照組比較，#P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01.

22尺骨骨髓切片組織學觀察

光鏡下觀察骨髓造血組織容量百分率，結果表明與正常對照組比較，實驗各組骨髓造血組織容量百分率均明顯降低(P<0.01)，但當歸注射液大劑量組及丙酸睪丸酮組較模型對照組顯著增高(P<0.01)，且當歸注射液大劑量組與丙酸睪丸酮組比較無顯著差異，而當歸注射液小劑量組與模型對照組比較無顯著差異。見表2。表2當歸注射液對免疫誘導再生障礙性貧血小鼠骨髓造血組織容量百分率的影響*注：與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.01。

23骨髓單個核細胞培養上清IL3的含量

采用ELISA法對正常對照組、模型對照組及當歸注射液大劑量組骨髓MNC培養上清進行檢測，結果發現，正常對照組IL3含量明顯高于模型對照組，而當歸注射液大劑量組的IL3含量亦明顯高于模型對照組。見表3。表3當歸注射液對免疫誘導再生障礙性貧血小鼠骨單個核細胞培養上清IL3的影響

3討論

31免疫誘導再生障礙性貧血小鼠模型的建立

在建立AA小鼠模型的過程中，照射和淋巴細胞的輸入是兩個必需的條件，合適的照射劑量既能降低造血干細胞的數量，引起骨髓儲備力下降，削弱宿主的免疫功能，抑制宿主的造血系統，誘發AA，又不至于使實驗動物過早死亡。本實驗AA模型經射線照射后，不僅造成造血細胞的死亡，對組成造血微環境的血竇、內皮細胞、外膜網狀細胞及吞噬細胞也造成損傷，呈現血竇壁斷裂，細胞器腫脹、變形等超微結構的變化。照射同時輸入的具有免疫活性的淋巴細胞可使造血微環境的損傷加重，病變持續存在，影響造血細胞的正常生長代謝，最終導致造血功能不能重建，出現不可逆的AA。因此本實驗模型小鼠的病理改變與人類AA相似。已知該模型AA發病時間集中在8~14天，高峰期為12天［3］，所以我們選擇第12天處死小鼠，獲取標本。

32AA的發病機理

AA是以全血細胞減少、骨髓造血功能衰竭為主要特征的一類貧血。目前，其發病機理主要認為與造血干細胞數目減少或功能缺失［5］，造血微環境的缺陷以及由造血微環境中基質細胞缺陷所致的正/負調節因子表達異常［6］相關。

造血微環境是造血干細胞生長、分化和自我更新的重要場所。主要由基質細胞、細胞外基質和微血管系統組成。基質細胞構成了骨髓微環境的網架結構，網架內充滿造血細胞；血竇由內皮細胞構成，竇腔內有成熟紅細胞和其他細胞，內皮細胞外有網狀細胞，營養和發育造血細胞［7］。基質細胞在造血調控方面發揮重要的作用。它不僅作為造血細胞生長的支架，而且可通過細胞間的直接作用和分泌多種造血生長因子來調節造血細胞的增殖、分化、成熟與釋放［8］。早已證實血竇的完整性及外膜網狀細胞在造血的支持和誘導中也有重要作用。

33當歸的藥理作用

當歸是中醫臨床最重要的補血活血藥物，過去多用于治療腰腿痛和婦科疾病，隨著臨床研究的進展，其用藥范圍逐漸擴大。作為補血藥物，其在血液系統疾病中的研究也日漸增多。

當歸的水溶性部分含阿魏酸，具有增加血流量、改善骨髓微環境的功能［9］，并能穩定紅細胞膜，保護紅細胞免受破壞［10］。

當歸多糖(angelicapolysaccharide,AP)是當歸中另一促進造血的有效成分。AP對貧血小鼠的紅細胞、血紅蛋白、白細胞和骨髓單個核細胞數恢復有顯著促進作用［11］。實驗表明，AP能顯著增加照射小鼠脾臟內源性造血灶的形成，提高照射小鼠骨髓單個核細胞計數，增強造血功能；能防止照射后效應，顯著促進照射小鼠多能造血干細胞形成單位(CFUS)和粒系定向干細胞形成單位(CFUC)的恢復［12］。對造血干細胞的增殖分化有顯著刺激作用［13］。而且，體內注射AP對正常或貧血小鼠的早期紅系祖細胞(BFUE)、晚期紅系祖細胞(CFUE)、粒單系祖細胞(CFUGM)和巨核系祖細胞(CFUMK)的增殖均有顯著促進作用［14］。

牛泱平等［15］采用體外造血祖細胞集落形成技術，首次觀察了當歸注射液對正常人和再生障礙性貧血患者骨髓紅系、粒系的作用，結果發現，當歸注射液能促進正常人和再生障礙性貧血患者骨髓造血干、祖細胞的增生和轉化。

當歸還具有多重調節免疫功能作用［16］。研究證實，當歸對免疫器官及細胞的再生以及機體的修復具有促進作用［17］。孟慶勇等［18］發現一定劑量的體內注射當歸注射液對正常及受輻射損傷小鼠脾淋巴細胞增殖具有明顯的刺激作用，有利于機體免疫功能的恢復。當歸注射液還能明顯抑制免疫抑制劑氫化可的松對大鼠脾細胞凋亡的誘導作用［19］。

當歸具有保護、促進和加速由于輻射引起的DNA合成抑制過程恢復的作用，或解除由輻射引起的物質代謝障礙［20］。劉玉蘭等［21］實驗證明當歸注射液腹腔用藥對輻射損傷的小鼠脾淋巴細胞增殖具有刺激作用，表明當歸注射液腹腔用藥具有抗輻射作用。

34當歸注射液對AA小鼠的保護作用

341對AA小鼠造血組織容量的影響本實驗模型對照組小鼠骨髓主要為脂肪細胞，造血細胞明顯減少，當歸注射液大劑量組能明顯提高造血組織容量百分，使造血細胞明顯增生。

邢金龍等的實驗結果［22］也證實當歸注射液具有清除氧自由基等有害物質，保護細胞器的作用。

342對骨髓微環境的影響本實驗模型對照組骨髓微環境損傷突出表現為骨髓間質主要為巨大的脂肪細胞，血竇擴張、充血，血竇內皮細胞核呈梭形，無核內小體，竇壁薄而直，甚至斷裂，無微絨毛，很少見到外膜網狀細胞。當歸注射液大劑量組造血小島增生，血竇豐富，血竇內皮細胞核為圓形或橢圓形，常見核內小體，竇壁較厚，有豐富的微絨毛。血竇的外膜網狀細胞常見。血竇的修復保證了細胞生長所需的營養物質及體液因子，無疑促進造血細胞、基質細胞的生長發育及其功能。

實驗證明，當歸注射液大劑量組與丙酸睪丸酮組比較，小鼠的體重，外周血白細胞、骨髓單個核細胞計數均無顯著差異，骨髓微環境變化也基本一致，說明大劑量組當歸注射液作用強度與丙酸睪丸酮相似。而經當歸注射液小劑量組治療的AA小鼠外周血白細胞、骨髓單個核細胞水平與模型對照組無顯著差異，說明達到一定劑量的當歸注射液才能對AA小鼠有保護作用。

343對BMNC培養上清中細胞因子IL3的影響本實驗分別檢測了正常對照組、模型對照組及當歸注射液大劑量組的骨髓MNC培養上清中IL3的含量，以期探討當歸注射液對AA小鼠的保護機理。

細胞增殖受細胞內外調控因子的影響，造血生長因子是一組調控造血干／祖細胞的增殖、分化及成熟血細胞功能的糖蛋白，它通過血液循環，到達骨髓造血組織，對其靶細胞發揮作用。根據其發揮的作用不同而分為正調控因子及負調控因子。白細胞介素3（IL3）是一種重要的正調控因子。IL3生物活性廣泛，通過激活干／祖細胞表面的IL3受體，促進造血干細胞的增殖與分化。此外，IL3還增強造血干細胞對其它造血生長因子的反應，發揮協同作用。因此，在幾乎所有的造血干細胞培養方案中都應用IL3，由此增生的造血干細胞被用來作基因轉染，及化療后的造血重建。IL3促進多能造血干細胞和各系祖細胞的定向分化與增殖，表現為對多種血細胞的生成有調節作用［23，24］。

35展望

當歸注射液能明顯促進AA小鼠骨髓造血細胞增生，改善骨髓造血微環境。其對AA小鼠的保護作用可能與其能提高骨髓造血細胞線粒體、內質網的數量，改善其質量。當歸注射液是否還通過其他途徑發揮作用有待進一步探討。從理論及部分實驗結果而言，當歸注射液可能是治療AA的有效藥物之一。

4結論

當歸注射液對免疫誘導小鼠再生障礙性貧血具有保護作用，能改善AA小鼠骨髓微環境，促進造血細胞增生。

當歸注射液保護作用的機制與其能提高骨髓中造血正調控因子IL3有關。

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