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篇1

目前與國家管轄范圍外海域海洋生物多樣性有關的《聯合國海洋法公約》以及《生物多樣性公約》，在關于國家管轄范圍之外海域生物多樣性的法律屬性問題上均未做出明確規定，這種獨特資源所具備的巨大價值，引起了國際社會的關注，與此同時，在發展中國家和發達國家之間帶來了一場巨大的爭議。本文通過對爭議和理論的分析，認為對于“區域”生物多樣性資源的法律屬性歸屬，應當選擇人類共同繼承財產原則，由全人類共同享有。

【關鍵詞】

國家管轄范圍外海域；UNCLOS；公海自由；人類共同繼承財產

《聯合國海洋法公約》（United Nations Convention on the Law of the Sea，簡稱UNCLOS）將海洋空間為若干區域，國家管轄權之外的海域，包括“區域”以及公海兩個部分。由于此海域的生物多樣性資源更是新型海洋資源，故而現有法律規定尚不能對其進行有效的規制。從生物多樣性保護的法律規定來看，《生物多樣性公約》（Convention on Biological Diversity，簡稱CBD）的主旨是在國家管轄范圍內的海洋生物多樣性的保護。具體而言，這兩部公約關于國家管轄范圍之外海域生物多樣性的法律屬性均未做出明確規定，國際社會為解決這一爭議舉行了諸多會議進行討論，但結果只是對國家管轄權范圍外海域海洋生物多樣性對人類社會的重要性，及需為其制定保護措施達成一致共識，但未對資源的法律屬性歸屬形成結論性的意見。這是因為，資源屬性這一問題牽涉到各國的根本利益，任何的妥協都會對本國利益造成難以彌補的損失。因此，在這一問題上，各國很難達成一致。

一、國家管轄范圍之外海域生物多樣性現有爭議

目前而言，國家管轄范圍之外海域海洋生物多樣性資源的法律屬性是發達國家和發展中國家爭議最大的地方，在國際會議中爭論激烈。

由于較早的開始了對國家管轄范圍外海域海洋生物多樣性資源的研究與開發，發達國家依靠雄厚資金和先進科技，在這一問題上占據了優先政治地位以及資源享有。以美國和日本為例，他們認為國家管轄范圍外海域生物多樣性資源應當適用公海自由原則，各國際主體在有足夠經濟及科技條件下可以自由的進行開發、利用，通過“先到先得”的方式取得，不應被任何國際主體依而占有。反對將UNCLOS第十一部分“區域”制度適用于深海基因資源，其理由是UNCLOS中有關“區域”資源的定義十分明確，即“區域”制度只適用于國家管轄范圍外海域深海底的礦產資源，據此，以美國和日本為首的的發達國家主張，深海基因資源的相關活動應遵循公海自由原則。

對此以我國為代表的發展中國家所成立的“77國集團”表示強烈的反對，巴基斯坦代表在聯合國海洋和海洋法問題不限成員名額非正式協商進程第八次會議上，代表77國集團和中國發言時就指出：“‘區域’內資源，包括海洋遺傳資源都是人類共同遺產的一部分”。發達國家不能依仗其優勢，通過公海自由原則以“先到先得”的方式占有，再利用知識產權保護制度，將該資源變為發達國家或其“陣營”的獨享權益。我們認為，UNCLOS中“區域”制度所獨有的共同繼承財產（或人類共同遺產）原則，既體現“區域”所獨有的地理環境和法律地位，又通過這一原則公平合理保護了各國在“區域”內的合法權益。因此應適用人類共同繼承財產原則，將該資源納入UNCLOS的“區域”制度范疇中，通過這一機制，使得發展中國家可以打破發達國家對深海生物多樣性資源的壟斷，分享其應有利益。

歐盟國家認為現有的法律制度和管理執行方面均存在著空白，應當從處理具體執行差距的基礎上，制定新制度完善現有法律框架。他們提議制定UNCLOS第三個執行協定，重點是在公海建立海洋保護區，以確保有效的海洋環境管理。

二、國家管轄范圍之外海域生物多樣性資源屬性法律理論

（一）公海自由原則

1609年荷蘭法學家格老秀斯在《海洋自由論》中指出：“流蕩不定的海水，必是自由的不能為任何國家所占有。”他主張海洋是全人類用之不竭的資源寶庫，這是公海自由所賦予人類的權利。據此發達國家提出，公海自由原則的確立遠早于UNCLOS的簽署，并且該原則已形成了完整的學術體系以及成熟實踐方式，不再需要一個新的制度對這一問題進行規制，過多的規制甚至會限制這一領域的科學發展。同時他們認為，在UNCLOS的相關條款中，已經明確列舉了“區域”內的資源是指礦產資源，因此，對于多樣性資源應當秉承公海自由原則，由各個國家自由取用。

（二）人類共同繼承財產原則

結合“區域”制度及相關表述可以得出，“區域”部分所包含的資源應當屬于全人類共同所有，由人類共同繼承。目前，雖然對該原則特征的表述認識存有爭議，但通常各觀點均認為要為和平目的而保護利用，排除單方侵占保證資源的人類共有性，以及為了后展的需要對現有資源進行合理有效的養護和利用。這些特點在UNCLOS的條文中均有包含，加之UNCLOS以明文形式闡述了“區域”及其資源是人類共同繼承財產，因此可以得出結論，UNCLOS要求各國在“區域”中的行為應以全人類的共同利益為考量，對于人類共同繼承財產的開發，即使各國不能實際參與開發利用活動，也可以通過合理的機構和制度分享開發所獲得的利益，并通過大會以及海底管理局等相關機構協調各方面的利益分配。

三、國家管轄范圍之外海域生物多樣性資源法律屬性分析

對于“區域”生物多樣性資源的法律屬性歸屬，應當選擇“人類共同繼承財產”，第一，國家管轄范圍之外海域生物多樣性資源的生存環境與普通海域不同，極端環境下所具有的獨特生態系統造就了動植物獨特的生存能力和生存方式，成就了其資源的獨特性以及人類社會對這一資源的不可復制性。這種這種獨特的地理生態環境造就了海洋生物多樣性資源極高的價值，因此該資源與“區域”地理環境具有高度的伴隨性，甚至可以說，國家管轄范圍外海域海洋生物多樣性資源與“區域”是一個密不可分的整體，與“區域”環境不可分割；第二，海洋法的健全完善，不但受時代背景的影響還受科學水平的左右。在UNCLOS關于“區域”資源定義做會議討論之時，關于國家管轄范圍外海域生物多樣性資源并沒

有出現在國際社會的認識之中，而當1977年熱夜噴口及相關生態系統被發現時，關于“區域”資源的定義已經被會議確立，因此現行1982年UNCLOS第十一部分并沒有涉及國家管轄范圍外海域的海洋生物多樣性資源。可通過梳理不難發現，設立“區域”制度時只是由于科技和人類認識的不足，導致在細化這一概念的內涵以及外延出現了法律空白，并非故意將其割裂；最后，通過UNCLOS序言可以得知，其目的是在于維護全人類的共同利益，而國家管轄范圍外海域海洋生物多樣性資源的開發與保護，是以發達的深海勘探技術為依托，雄厚的經濟實力為支持，這就尤其需要各國攜手共同合作。從這一點而言，是符合人類共同繼承財產這一法律屬性的，即需要國際社會共同來攜手合作、維護管理以及科考研究。

參考文獻：

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[6]賈桂德，尹文強.國際海洋法發展的一些重要動向[J]，太平洋學報，2012.1

[7]金建才.深海底生物多樣性與基因資源管理問題[J]，地球科學進展，2005.1

篇2

關鍵詞：土壤類型；煙田土壤微生物；根土比；多樣性指數

中圖分類號：S154 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）01-0056-04

土壤微生物是陸地生態系統中最豐富的物種，相關研究表明，每克農田土壤擁有的基因組量為140～8 800個，相當于400～26 000個不同物種。土壤微生物組成與活性決定了生物地球化學循環、土壤有機質的周轉及土壤肥力和質量，也與植物的生產力有關。土壤微生物還可以敏感地指示氣候和土壤環境條件的變化，土壤微生物參數可能是最早用于反映土壤質量的指標。土地利用方式、種植制度、農地管理方式及作物種類都會對土壤微生物產生影響[1-3]。Waldrop等[4]在研究森林轉換為耕地條件下的土壤微生物群落結構時發現土壤中有機碳和氮下降了50%～55%，微生物量下降了75%，β-葡萄糖苷酶活性下降了54%，微生物特征和種類發生明顯的變化。

土壤類型對微生物生長發育有著較大影響。土壤類型不同，土壤微生物種群數量和組成也必然會存在某種程度的差別，這種差異反過來又會對土壤結構以及土壤肥力特別是對煙草的生長產生一定的影響[5]。土壤微生物是土壤中動植物殘體分解的主要推動者，在土壤物質轉化中具有多種重要作用，與土壤肥力和植物營養有密切關系。因此土壤微生物是反映土壤供肥能力、土壤健康狀況的敏感性參數。為此，在湖北省保康縣和興山縣選取兩種有代表性的土壤類型，研究不同類型土壤中主要微生物類群數量的變化規律，為合理利用土地資源、保證其可持續發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2009年5～12月在湖北省保康縣和興山縣進行。選取黃棕壤和紫色土兩種土壤類型，育苗、肥水管理、病蟲害防治及其他田間管理均按照當地農民種植習慣進行。供試煙草品種為K326。

1.2 土壤樣品采集

分別于移栽前期（5月12-13日）、旺長期（7月8-9日）及采收期（8月15-16日）取樣。采用5點取樣法采集5～20 cm根際土和非根際土，用無菌自封袋包裝，立即帶回實驗室。將新鮮土樣研磨過2 mm篩存放在4 ℃冰箱中。

1.3 土壤微生物測定

采用稀釋平板法測定土壤微生物總數；細菌采用牛肉膏蛋白胨固體培養基；固氮菌采用阿須貝氏瓊脂培養基；放線菌采用高氏1號培養基；真菌采用馬丁氏（Martin）培養基。結果以每克干土所含微生物數量表示[6]。

1.4 數據分析

根土比（R/S）是指根際土中微生物數量與非根際土中微生物數量的比，其中R表示根際土中微生物數量，S表示非根際土中微生物數量。

微生物數量變化速率是指根際土中微生物數量與移栽前期根際土中微生物數量的比。

生物多樣性指數是描述生物類型數和均勻度的一個度量指標，它在一定程度上可反映生物群落中物種的豐富度及其各類型間的分布比例。本研究中土壤微生物菌群多樣性指數和土壤微生物菌群的均勻度計算方法如下：

1）土壤微生物菌群多樣性指數（Shannon-Wiener指數[7]）：H=-∑Pi×1nPi

2）土壤微生物菌群的均勻度[8]：

R=（-∑Pi×1nPi）/1nS

式中，Pi=Ni/N為某群落中第i個類型的個體數占總個體數的百分比，S為微生物類群數量。

2 結果與分析

2.1 不同類型煙田土壤中微生物數量

由圖1至圖4可知，在不同土壤類型煙田土壤中4種微生物數量從多到少依次為：細菌、固氮菌、放線菌、真菌。其中，細菌數量最多，占微生物總量的58.77%～82.98%，固氮菌占微生物總量的10.80%～32.75%，放線菌占微生物總量的3.79%～10.39%，真菌數量最少，占微生物總量的0.04%～0.22%。由此可見細菌在煙田土壤微生物中占絕對優勢。

在不同生育時期不同土壤類型的煙田土壤中，旺長期細菌數量高于采收期，保康縣黃棕壤和紫色土煙田旺長期土壤中細菌數量分別為11.740 2×107 cfu/g和11.654 2×107 cfu/g，興山縣黃棕壤和紫色土煙田旺長期土壤中細菌數量分別為29.437 0×107 cfu/g和11.295 9×107 cfu/g。

不同類型的煙田土壤中，黃棕壤中細菌和固氮菌數量均高于紫色土，保康縣黃棕壤煙田旺長期土壤中細菌和固氮菌數量分別為11.740 2×107 cfu/g和24.033 4×106 cfu/g，保康縣紫色土煙田旺長期土壤中細菌和固氮菌數量分別為11.654 2×107 cfu/g和15.163 0×106 cfu/g；保康縣黃棕壤煙田采收期土壤中細菌和固氮菌數量分別為11.250 4×107 cfu/g和34.551 7×106 cfu/g，保康縣紫色土煙田采收期土壤中細菌和固氮菌數量分別為10.302 8×107 cfu/g和31.938 6×106 cfu/g。興山縣黃棕壤煙田旺長期土壤中細菌和固氮菌數量分別為29.437 0×107 cfu/g和99.007 3×106 cfu/g，興山縣紫色土煙田旺長期土壤中細菌和固氮菌數量分別為11.295 9×107 cfu/g和32.766 6×106 cfu/g；興山縣黃棕壤煙田采收期土壤中細菌和固氮菌數量分別為16.694 6×107 cfu/g和66.275 2×106 cfu/g，興山縣紫色土煙田采收期土壤中細菌和固氮菌數量分別為7.679 0×107 cfu/g和23.956 8×106 cfu/g。

2.2 不同類型煙田土壤中微生物數量變化速率

以移栽前期根際土中微生物數量為參照，不同類型煙田土壤中微生物數量變化速率如圖5和圖6所示，黃棕壤中細菌、固氮菌、放線菌和真菌的變化速率都高于1，表明在煙草生長過程中黃棕壤煙田土壤中細菌、固氮菌、放線菌和真菌數量在增加，而紫色土中固氮菌和放線菌的變化速率存在低于1的情況，表明在煙草生長過程中紫色土煙田土壤中固氮菌和放線菌數量存在減少的趨勢。

在黃棕壤煙田土壤中，細菌變化速率高于固氮菌變化速率，固氮菌變化速率高于放線菌變化速率，放線菌變化速率高于真菌變化速率。在興山縣黃棕壤煙田旺長期土壤中，細菌、固氮菌、放線菌和真菌的變化速率分別為6.895 5、4.161 8、2.561 1和1.529 9。

在不同類型煙田土壤中，黃棕壤煙田土壤中細菌變化速率、固氮菌變化速率、放線菌變化速率和真菌變化速率分別高于紫色土中4種微生物變化速率。興山縣黃棕壤煙田采收期土壤中，細菌、固氮菌、放線菌和真菌的變化速率分別為3.910 7、2.785 9、2.659 0和2.136 4，興山縣紫色土煙田采收期土壤中，細菌、固氮菌、放線菌和真菌的變化速率分別為1.636 5、1.527 7、1.583 8和1.911 7。

2.3 不同類型煙田根際土中微生物根土比

由圖7和圖8可知，不同類型土壤中細菌、固氮菌、放線菌和真菌根土比都大于1，表明根際土中細菌、固氮菌、放線菌和真菌數量均高于非根際土，表現出明顯的根際效應。不同類型煙田土壤中，黃棕壤中固氮菌根土比高于紫色土，興山縣黃棕壤中固氮菌根土比最高，為7.007 1。黃棕壤中4種微生物根土比之和高于紫色土，旺長期保康縣黃棕壤和紫色土中4種微生物根土比之和分別為5.958 3和4.820 9，旺長期興山縣黃棕壤和紫色土中4種微生物根土比之和分別為13.852 2和6.742 4。

2.4 不同類型煙田土壤中微生物種群結構變化

細菌與真菌數量的比值（B/F）是表征土壤肥力的一個潛在指標。有資料表明，土壤中細菌密度高，表明土壤肥力水平較高。表1為不同土壤類型煙田土壤中微生物的B/F變化趨勢。黃棕壤煙田土壤中旺長期細菌與真菌數量的比值（B/F）高于采收期，興山縣黃棕壤煙田土壤中旺長期和采收期細菌與真菌數量的比值（B/F）分別為26.431 4和11.541 7。不同類型煙田土壤中，黃棕壤中細菌與真菌數量的比值（B/F）幾乎都高于紫色土，興山縣黃棕壤中旺長期細菌與真菌數量的比值（B/F）最高，為26.431 4。黃棕壤煙田土壤中細菌與真菌數量的比值（B/F）高于紫色土，表明黃棕壤煙田土壤更適合煙草種植。

2.5 不同土壤類型對土壤微生物多樣性指數的影響

土壤微生物菌群多樣性指數（H）反映微生物群落的豐富度，用根際土中微生物菌群多樣性指數與非根際土中微生物菌群多樣性指數之比（R/S）衡量煙葉種植對煙田生態系統中微生物多樣性指數的影響。從表2可知，黃棕壤根土比大于紫色土。保康縣黃棕壤和紫色土根土比分別為0.887 18和0.748 94，興山縣黃棕壤和紫色土根土比分別為1.019 26和0.866 43。

3 小結

對不同類型的煙田土壤中細菌、固氮菌、放線菌和真菌進行分離，對不同微生物種群進行數量和多樣性分析。結果表明，不同類型煙田根際土壤中，黃棕壤中細菌和固氮菌數量均高于紫色土。在黃棕壤煙田土壤中，細菌變化速率高于固氮菌變化速率，固氮菌變化速率高于放線菌變化速率，放線菌變化速率高于真菌變化速率。黃棕壤煙田土壤中細菌、固氮菌、放線菌和真菌變化速率分別高于紫色土中4種微生物變化速率。黃棕壤中4種微生物根土比之和高于紫色土，興山縣黃棕壤中固氮菌根土比最高。黃棕壤中細菌與真菌數量的比值（B/F）幾乎都高于紫色土，興山縣黃棕壤中旺長期細菌與真菌數量的比值（B/F）最高，為26.431 4。黃棕壤根際土中微生物菌群多樣性指數與非根際土中微生物菌群多樣性指數之比高于紫色土。

參考文獻：

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篇3

Abstract： Based on the comparative study of the number and groups of bacteria in inside and outside of the Xiaotongzi Forest soil （0-30cm） in Shuangbai County， this paper made variance analysis and diversity indices analysis on the bacteria. After the related experiments， the results show that： the number of bacteria inside and outside the forest has a significant difference （p

關鍵詞： 小桐子林地；細菌群落；細菌多樣性

Key words： Xiaotongzi Forest；bacteria groups；bacteria diversity

中圖分類號：S792 文獻標識碼：A 文章編號：1006-4311（2014）19-0321-02

0 引言

小桐子，其自然學名為落葉灌木，這種樹的生長環境很廣泛，主要生長在氣候比較干熱的亞熱帶和熱帶雨林。該種樹耐干旱，能適應貧瘠的土壤環境。小桐子的自然價值和社會經濟效益比較高，可以用作工業生產中的原材料，在農業和環保及生態建設領域均有重要的應用價值，其在藥用方面有很高的藥物學價值。隨著社會生產對傳統資源消耗的日益增多，生物能源的利用逐漸進入科學研究的視野。在土壤的生態系統（如圖1）中，微生物的分布對于土壤的發育狀況有著十分重要的影響作用，土壤微生物中分參與土壤的能量轉化，為林地的生物多樣性提供了必要的土壤營養基礎，小桐子林木屬于生物能源的范疇，其生長和發育的好壞，關系到林木資源的開發利用程度的高低。本文主要分析了林地土壤微生物多樣性對于林木生長的相關影響。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況 本實驗的地區位于云南省楚雄州雙柏縣，東經101°03′-102°03′，北緯24°03′-24°55′，海拔556m-2946m，處在低緯度的山地，其氣候從細分來看是亞熱帶高原季風氣候。常年平均氣溫在15℃左右，一年之中月最低氣溫平均9.2℃，夏季最熱月的平均氣溫達到36℃，通常年平均降水920.1mm，年平均相對濕度72%。

1.2 材料

1.2.1 土樣的采集 土壤樣品于2011年8月采集于云南雙柏縣，采集0cm-30cm表層，5cm為一個層次，共7個層次。

1.2.2 使用到的試劑 本實驗主要使用牛肉膏蛋白胨培養基。如圖2。

1.3 主要實驗方法及實驗步驟

1.3.1 測定土壤的含水量 先稱取待測土壤的樣品，在烘干冷卻后稱其重量，根據以下公式計算其含水量：土壤含水量=（濕土重-干土重）/濕土重×100%。

1.3.2 測定土壤的微生物，采用比較常見的測量方法――稀釋涂布平板法。

1.3.3 統計分析 本實驗的數據統計采用SPSS17.0統計軟件進行，再對相關數據處理分析后，形成實驗數據報告。

2 結果與分析

2.1 土壤細菌的數量分布（如圖3）

表1為土壤細菌數量值及其差異。方差分析表明：不同采樣點小桐子林土壤細菌在土壤中的垂直分布存在差異。土壤細菌數量在各個樣地有共同特點，即30cm處土壤細菌數量最少，在15cm處最多，5cm層細菌數量比0cm層多。

2.2 林內林外小桐子林地土壤細菌群落多樣性分析 林內樣地土壤細菌4種多樣性指數除豐富度指數（S）外，其它均小于林外樣地。林外樣地Shannon多樣性指數比林內樣地高0.3%，說明調查樣地林內與林外物種豐富度相近（圖4）。

3 本實驗的相關結論和討論

3.1 在細菌數量的分布上，小桐子林外要比林內多。因為小桐子林成林時間較短，在林木下面的植被也不是很濃密繁茂，同時當地氣候降雨量較小，光照比較充足，所以蒸發量很大。在土壤的中下層集中了大量的水分，而土壤上層較少。在樹林內部的樹枝、樹葉凋落較多，在土壤中腐爛后形成有機物，其中氮磷鉀的含量比沒有樹葉樹枝腐爛的地方高很多，這些地方的土壤肥沃，適合細菌的生長。

3.2 兩樣地表層的細菌數量都比較少，這種原因主要是土壤類型不同，這些土層比較淺，土壤中有含有大量砂礫，在土壤厚度增加的同時，其緊實度、致密度也隨之增加。過于致密的土壤不利于透氣、透水，這種不利條件限制了有氧細菌的生長。

3.3 土壤細菌的分布在數量上呈現一定的垂直差異，其中主要的規律為先增后減。具體來說在15cm的地方出現最大值。這種情況與土壤的透氣性和含水量密切相關。

參考文獻：

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篇4

關鍵詞：環境工程；分子生物；微生物；應用

前言：作為集環境監測、環境工程、保護學以及微生物學于一體的學科，微生物學在不斷發展中逐漸衍生出較多亟待解決的問題。盡管近年來有較多先進理念與技術被引入該學科中，但對于部分環境監測或環境凈化等問題，所取得的效果并不理想，要求充分發揮分子生物技術的優勢。因此，本文對環境工程微生物中分子微生物技術的應用分析，具有十分重要的意義。

1分子生物技術的相關概述

1.1測序技術

細胞中的rDNA本身表現出明顯的高突序列、保守序列以及穩定特征，但其是分類微生物中的指標之一。通常測序分析中，為使微生物種群得以分析，對分離物或分類單元進行確定，便需借助rRNA分析方式。從該基因序列的類型看，有較多如16SrRNA、23SrRNA與5sRNA，其中后兩者包含的含核苷酸分別過多與過少，很難為測序分析提供指導。所以在原核生物系統研究中，可考慮將16SrRNA引入。具體測定中，會在如TA克隆試劑、PGEM-T克隆試劑等載體應用下，克隆PCR產物，完成文庫構建過程，在此基礎上結合16SrRNA基因測序結果，可通過其與文庫中的序列做好對比，判斷是否有相對應或相似微生物種類。另外，也可對rDNA多樣性利用電泳分離進行顯示，或直接通過RFLP對擴增產物做好分析。通過這些測序方法的應用，對微生物系統發育的研究可起到重要作用[1]。

1.2核酸技術

核酸技術在分子生物技術中極為常見，可具體細化為PCR-SSCP、PCR-DGGE與PCR-RFLP等技術。以其中PCR-SSCP技術為例，其以往運用中多局限在基因突變方面，是臨床醫學中的常用方法，經過不斷發展被引入到微生物生態學中。從其實現原理看，主要以單鏈DNA空間折疊構象為基礎，若其中有堿基出現變化，空間構象會隨之發生變化，配合聚丙烯酰胺凝膠電泳的應用，使DNA譜帶得以生成。以16SrRNA測序在廢水生物中的表現為例，便可借助PCR-SSCP，對細菌群落受培養基變化的影響進行分析。再如PCR-DGGE，應用中一般強調將基因組DNA從環境樣品內被提取，在此基礎上將PCR擴增技術引入，可達到擴增DNA的目標，此時可將聚丙烯酰胺凝膠與擴增產物相結合，通過電泳作用分離雙鏈DN段，最終生成的將為單鏈DNA譜帶。最后便可對譜帶中展現的堿基序列與文庫內序列做好對比分析，完成微生物種屬的界定。由于該技術具有較好的分離效果，操作較為簡便，所以在微生物分析中的應用較為常見，如對微生物種群在活性污泥中的情況判斷，將該技術引入，可起到良好的效果。另外，在PCR-RFLP技術方面，其主要借助核酸特異位點、DNA識別序列，對雙鏈DNA進行切割，配合溴化乙錠凝膠的應用，無需通過放射性標記形式，便可達到DN段分析目標。如土壤中微生物的判斷，便可借助該技術實現。

1.3基因探針

目前分子生物技術中，基因探針的引入主要借助熒光染料、放射性同位素，對樣品內核酸進行識別分析。對于該技術，也表現在核酸印跡、熒光原位以及放射性標記探針等技術方面。其中放射性探針應用下，盡管對于寡核苷酸、RNA或單鏈DNA等都可進行標記，但其涉及的同位素具有較高的成本，很容易危害人體健康，所以使用中受到較大的限制。而對于熒光原位，應用中一般可做好細菌空間位置標識或定量定性判斷細菌情況等工作。另外，在核酸印跡方面，其適用對象集中表現在PCR擴增產物方面，對微生物風度、多樣性檢測都可起到重要作用[2]。

2環境工程微生物領域中分子生物技術的應用分析

2.1微生物群種豐度與多樣性的分析

現行環境工程領域中，通常需檢測的對象多表現在底泥、土壤、生物膜以及污泥方面。從現行較多實踐研究都可發現，若將16SrRNA從菌落中提取出來并開展測序工作，可對微生物種群在活性污泥中的情況被測定，并將聚光激光掃描、熒光顯微以及FISH等技術引入，可定位生物膜中的微生物或檢測其活性。再以城市地區垃圾填埋細菌的分析，可在ARDRA方法的運用下，使細菌多樣性情況以及細菌結構被有效判斷。這些都可充分說明微生物豐度、多樣性都可在分子微生物技術應用下被有效判斷，通過定量或定性檢測得到的結果，能夠為環境工程中較多工藝操作、構筑物設計提供參考。

2.2指示微生物與致病菌的有效檢測

環境工程研究中，可發現在土壤、水體或空氣等媒介作用下，致病菌很可能對人體造成較大威脅，如典型的SARS。對此，便可借助分子微生物完成致病菌測定工作，如部分學者將16SrRNA基因、PRC-DGGE技術共同引入，對垃圾場、污水處理廠以及大學校園中的空氣環境進行測定，可發現在以往微生物培養下，很難測定氣溶膠微生物情況。另外，對于水體內是否有大腸桿菌等DNA存在，也可借助分子微生物技術進行判斷。這些都可充分說明，對于指示微生物、致病菌的檢測，分子生物技術應用效果都較為明顯。

2.3功能微生物的培養

由于當前化工行業發展步伐較快，其帶來的過多有機化合物也成為環境工程領域面臨的難題，很多有機化合物如含苯環類型，很難實現快速降解目標。對此問題，大多學者通過實驗方式，發現分子生物技術應用下可使這種現狀得以改變，如對甲苯質粒、降解萘利用DNA印跡雜交形式，可使這兩種質粒微生物被判斷。此外，對于其他難以降解的有機物，都可采用質粒如工程、基因重組等方式，使功能群被構建，使有機物難以被降解的問題得以解決[3]。

3結論

分子生物技術的應用是現行微生物研究的重要保障。實際引入該技術中，應正確認識分子生物技術的實現原理，包括測序技術、基因探針以及核酸技術等，在此基礎上將其融入致病菌檢測、功能微生物培養以及微生物多樣性分析等方面，能夠推動環境工程微生物學的進一步發展。

參考文獻

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[2]張鳳.在環境工程微生物領域中分子生物技術的應用[J].綠色科技,2013,08:192-194.

篇5

雙生子研究是一種經典的流行病學研究方法，主要通過對雙生子群體的研究，即比較同卵雙生子和異卵雙生子性狀的相似性來判斷遺傳和環境哪種對于疾病或性狀更為主要的一種方法。同卵雙生子（monozygotic twins）具有基本相同的遺傳物質，表型特征極為相似。同卵雙生子之間的差異可以排除遺傳因素的作用，可用以研究不同環境因素對表型的影響。異卵雙生子（dizygotic twins）具有50%相同的遺傳物質，其在特點上無異于兩次不同妊娠的同胞，但雙生子同胞之間具有相同的年齡，進行比較時可以避免年齡的混雜，同時也可以排除不同子宮環境對胎兒發育及疾病所帶來的影響。通過比較同卵及異卵雙生子性狀的差異，可以分析遺傳和環境兩個方面對個體性狀的影響。本研究擬通過雙生子法，以聚合酶鏈反應-變性梯度[專業提供寫作論文和論文寫作服務，歡迎您的光臨dylw.net]凝膠電泳（polyme-rase chain reaction-denaturing gradient gel electropho-resis，PCR-DGGE）分析雙生子兒童口腔微生物群組結構構成的差異，從而觀察遺傳及環境因素對人口腔微生物群組結構構成的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗對象

隨機選取2011年8月—2012年3月于四川大學華西口腔醫院兒童口腔科就診的雙生子兒童20對，年齡3～11歲，根據WHO口腔健康調查基本方法第三版齲病診斷標準，記錄齲失補牙面（dmfs/DMFS）指數。其中有齲者17人，無齲者23人。

所有入選雙生子兒童為共同生活背景，無全身系統性疾病史，3個月內無全身使用抗生素史，未使用激素類藥物及免疫抑制劑，1周內口腔局部未使用抗生素。兒童及其法定監護人知情同意。

根據兒童牙列情況分為乳牙列組以及混合牙列組。乳牙列組雙生子共10對，年齡3～6歲，其中無齲（caries free）兒童13人，有齲（caries）兒童7人，dmfs指數為2.29±1.38。混合牙列組雙生子共10對，年齡6～11歲，其中無齲兒童10人，有齲兒童10人，dmfs/DMFS指數為7.20±4.42。

1.2 卵形鑒定

用無菌棉簽采集兒童口腔黏膜樣本，鑒定雙生子兒童卵形。采用16個多態標記（D3S1358，vWA，FGA，AMEL，D8S1179，D21S11，D18S51，D5S818，D13S317，D7S820，TH01，PE，D16S539，CSF1P0，PD，TPOX）的基因分型對所有雙生子進行卵形鑒定。20對雙生子中，同卵雙生子10對，異卵雙生子10對；乳牙列組中同卵雙生子3對，異卵雙生子7對；混合牙列組中同卵雙生子7對，異卵雙生子3對。

1.3 唾液樣本采集

進食后2 h取樣，清水漱口后采集非刺激性唾液，直接用加樣槍從受試者口底采集，采集量為5 mL。采集的唾液放入離心管內，冰浴下2 h內放入-80 ℃冰箱凍存。

1.4 DNA提取

將臨床采集的唾液樣本在室溫下解凍，將唾液樣本混合，2 600×g離心10 min，沉淀樣本中的殘渣及真核細胞，取上清，14 000×g離心5 min，棄上清，收集細菌沉淀用于提取DNA和PCR-DGGE分析，以獲得原始唾液細菌譜。利用QIAamp DNA Micro Kit提取全基因組DNA，提取產物使用Pigogreen熒光定量法測定濃度，A260/A280測定DNA純度。

1.5 16s rRNA基因擴增及PCR-DGGE分析

使用通用引物bal 1（5’-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC GAC TAC GTG CCA GCA GCC-3’）、bal 2（5’-GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC C-3’）擴增DNA樣本16s rRNA基因，擴增產物長度約300 bp。PCR反應體系：PCR master mix預混液25 μL，25 mmol·L-1引物各1 μL，100 ng純化基因組DNA，加去離子水補足50 μL。循環條件：起始步驟94 ℃變性3 min；94 ℃變性1 mi[專業提供寫作論文和論文寫作服務，歡迎您的光臨dylw.net]n，56 ℃退火1 min，72 ℃延長2 min，30個循環；72 ℃延長5 min。取PCR擴增產物5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，0.5 μg·mL-1溴化乙錠染色后置長波紫外光下觀察。

以8%的聚丙烯酰胺凝膠形成40%（含2.8 mol·L-1尿素及24%甲酰胺）至60%（含4.2 mol·L-1尿素及24%甲酰胺）的線性濃度梯度。每個加樣孔中加入約300 ng的PCR產物。將凝膠浸沒于裝有1×TAE緩沖液（40 mmol·L-1 Tris base，40 mmol·L-1冰醋酸，1 mmol·L-1乙二胺四乙酸）的電泳槽中，使用Bio-Rad Dcode系統恒定60 V電壓，58 ℃下電泳17 h。電泳完成后，TAE緩沖液漂洗凝膠，含0.5 μg·mL-1溴化乙錠的1×TAE緩沖液染色15 min后用1×TAE漂洗15 min洗去多余染料。使用Molecular Imager Gel Documentation system獲取并記錄PCR-DGGE凝膠的數碼圖像[3]。

1.6 數據分析

使用Quantity one軟件標記PCR-DGGE圖譜條帶，并使用非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）構建系統發育樹，得到相似性矩陣（similarity matrix）。使用Quantity one軟件導出實驗數據后，計算多樣性指數（Shannon index）及PCR-DGGE條帶數。

采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。數據服從正態分布者采用獨立樣本t檢驗，不服從者采用獨立樣本t’檢驗。

2 結果

2.1 PCR-DGGE圖譜分析

乳牙列組PCR-DGGE圖譜見圖1。泳道2～6、8、11為有齲者，7、9、10、12～21為無齲者。

2.2 UPGMA系統發育樹

乳牙列組UPGMA系統發育樹見圖3。2-3、4-5、6-7、10-11、14-15、16-17、18-19為異卵雙生子，8-9、12-13、20-21為同卵雙生子。除6-7這對雙生子外，其余9對雙生子之間均出現明顯聚類（90%），但同卵雙生子和異卵雙生子間無統計學差異（P>0.05）。混合牙列組UPGMA系統發育樹見圖4。1-2、3-4、7-8、9-10、11-12、13-14、19-20為同卵雙生子，5-6、15-16、17-18為異卵雙生子。6對雙生子之間有明顯聚類（60%），但同卵雙生子和異卵雙生子之間無統計學差異（P>0.05）。

在乳牙列組中，同卵雙生子的相似性 為75.70±1.70，異卵雙生子的相似性為71.83±6.69，兩者間無統計學差異（P=0.21）；混合牙列組中，同卵雙生子的相似性為58.53±10.37，異卵雙生子的相似性為57.87±21.51，兩者間無統計學差異（P=0.86）。這說明在乳牙列及混合牙列同卵及異卵雙生子中，口腔微生物組成的相似性無明顯差異，遺傳因素對口腔菌群微生物構成的作用可能小于環境因素。

2.3 口腔微生物多樣性分析

雙生子兒童口腔微生物PCR-DGGE條帶數及多樣性指數分析見表1。乳牙列組中，有齲兒童的PCR-

DGGE條帶數及多樣性指數低于無齲兒童，且兩者間均具有統計學差異（P<0.05）。混合牙列組中，有齲兒童的PCR-DGGE條帶數及多樣性指數低于無齲兒童，但兩者間均無統計學差異（P>0.05）。

3 討論

PCR-DGGE[專業提供寫作論文和論文寫作服務，歡迎您的光臨dylw.net]是一種非培養指紋圖譜方法，通過PCR-DGGE方法可以在同一塊膠上觀察不同的細菌種類。利用細菌16S rRNA基因進行PCR特異性擴增結合DGGE分析已成為研究微生物群落多樣性的常規方法。本研究發現乳牙列組有齲兒童中，唾液細菌的多樣性較低，而無齲兒童唾液細菌的多樣性較高。在混合牙列雙生子中，雖然無齲與有齲兒童的細菌多樣性無統計學差異，但仍能看出患齲后微生物多樣性減少的趨勢。推測其可能的原因是：有齲兒童口腔內可能有更高比例的產酸菌及耐酸菌[4-5]，且其口腔微環境可能更適合致齲菌的生存，所以致齲菌的比例升高，從而導致細菌整體豐度下降[6-7]。

在本研究中，通過PCR-DGGE聚類分析可以發現，大多數雙生子出現明顯聚類，其中，乳牙列雙生子中有9對出現明顯聚類（90%），混合牙列雙生子中有6對出現明顯聚類（60%），這證明在大部分雙生子之間，口腔菌群微生物構成的相似性非常高。但同時可以看到，無論是乳牙列還是混合牙列，同卵雙生子和異卵雙生子之間的口腔菌群相似性均沒有明顯差異，說明在口腔微生物菌群構成中，環境因素（共同生活等）的影響可能更大于遺傳因素。同時，乳牙列兒童雙生子的口腔菌群構成相似程度（90%）與混合牙列雙生子的菌群構成相似程度（60%）不同，這與其他學者[8]的研究結果相吻合。

Corby等[9]的研究顯示，遺傳因素對唾液中的細菌定植有顯著影響。其他學者[10]的研究也證實遺傳因素對人及動物模型中唾液變異鏈球菌的定植及齲易感性均有明顯影響。本研究結果也顯示，有齲兒童及無齲兒童唾液微生物的種類有所不同，有齲兒童的唾液微生物種類減少。在同卵及異卵雙生子中，均發現有較高的口腔微生物菌群相似性，而這種相似性在同卵雙生子及異卵雙生子之間沒有發現差異。混合牙列雙生子中口腔微生物的相似性低于乳牙列雙生子，可以由此推測，在口腔微生物菌群構成中，環境的作用可能大于遺傳的作用。

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篇6

【關鍵詞】牙髓病；根尖周病；微生物檢測；分子生物學

【中圖分類號】R781.3

【文獻標志碼】A

微生物種類繁多，自然界中僅有極少數微生物得到了鑒定，能夠在實驗室培養的種類則更少，至多為1％。傳統的牙髓感染細菌厭氧分離培養影響因素多，鑒定困難。隨著分子生物學技術的發展，更多的微生物在根管中檢出。16S　rD-NA指紋技術、克隆文庫、核酸雜交等技術的應用使人們對牙髓根尖周病微生物組成的認識更加全面，對于進一步分析其協同作用等致病機制有所幫助。

1　16S　rDNA指紋技術

指紋技術都是基于聚合酶鏈式反應（polymerase　chain　reaction，PCR）基礎上的，其特異性的擴增產物代表著微生態系統中的微生物多樣性。傳統指紋技術有末端限制性長度多態性（terminal-restric-tion　fragment　length　polymorphism，T-RFLP）、變性梯度凝膠電泳（denaturing　gradient　gel　elec-trophoresis，DGGE）和溫度梯度凝膠電泳（tem-pe-rature　gradient　gel　electrophoresis，TGGE）。傳統指紋技術主要根據擴增產物不同的解鏈特性，使相同相對分子質量的DNA分子根據堿基組成特點得以分離，已廣泛應用于微生物生態系統研究。

T-RFLP以PCR法為基礎，擴增的是特定的標志基因（如16S　rDNA），用熒光標志引物擴增產生的PCR產物攜帶熒光標簽。擴增產物來源于不同細菌，它們擁有不同的限制性核酸內切酶酶切位點，水解的PCR產物則產生不同的帶形和指紋圖譜。能檢測到先前未鑒定或未能培養的細菌，但該技術比較費時費錢，重復性較差。

2004年，Hommez等將T-RFLP法應用于感染根管細菌組成的研究中；但是沒有強大的數據庫支持，通用引物擴增存在偏嗜性，酶切后T-RFLP的長度分布也會低估復雜群落的多樣性，這些問題使這種實驗方法尚沒有完全發揮其潛能。

DGGE是在聚丙烯酰胺凝膠中加入線性梯度的DNA變性劑，在不同的變性劑濃度下，DNA分子解鏈的程度不同，當DNA分子解鏈到電泳時產生的遷移阻力與電場力相平衡時，便停留在這一特定變性劑濃度的凝膠帶中，從而使相同的相對分子質量的DNA分子根據堿基組成特點得以分離。Siqueira等應用DGGE方法比較了挪威及巴西慢性根尖周炎患者感染根管的細菌組成，分別檢出了9.2和10.5個細菌條帶，由此得出，感染細菌的組成在樣本個體間差異明顯，同一地區樣本的細菌組成具有相似性。

單純比較條帶數及條帶位置只能推導出具有相關性的結論，要明確細菌組成則需要聯合應用這些檢測方法。Yang等用PCR-DGGE結合克隆測序方法研究了急性根尖周膿腫的細菌組成后發現，檢出頻率由高到低的細菌依次是普雷沃菌、梭桿菌、消化鏈球菌、卟啉單胞菌、鏈球菌、真桿菌、乳酸桿菌、彎曲菌、螺旋體、布雷德菌。與培養法研究乳牙急性根尖周炎的根管優勢菌為產黑色素普雷沃菌、微小消化鏈球菌的結果相似。對于難培養的牙密螺旋體和布雷德菌也有27.3％和36.4％的檢出率，比以往文獻的檢出率大大提高，從而提示牙密螺旋體和布雷德菌可能是乳牙急性根尖周膿腫的致病菌。

利用指紋技術研究菌群組成已被證實是可行的，通過比較指紋圖譜可以了解不同個體或者不同生境的菌群組成差異。

2　實時熒光定量PCR技術及屬、種特異性PCR

實時熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現多重反應、無污染、具實時性和準確性等特點，定量PCR技術在牙周致病菌檢測等方面已經應用多年。

Saito等利用定量PCR技術檢測了32例感染根管中牙齦卟啉單胞菌和福賽斯坦納菌，發現其檢出率分別為28％和66％，兩種菌同時出現的樣本比例是22％，其范圍分別為5.65×10-6～1.20×10-2和5.76×10-6～1.35×10-1；由此得出牙齦卟啉單胞菌和福賽斯坦納菌與牙髓感染時的臨床癥狀無明顯相關性。

Rocas等討論了糞腸球菌的出現與不同類型根尖炎之間的關系，實驗選擇擴增特異性高的巢式PCR對樣本16S　rDN段進行擴增，在原發感染的50例患牙中糞腸球菌的檢出為9例，陽性率為18％；而在30例無癥狀的已經進行根管充填但是伴有慢性根尖病損的患牙中糞腸球菌的檢出率為20例，陽性率為66.7％。這個結果表明糞腸球菌在無癥狀的患牙中檢出率高于有癥狀的患牙，提示糞腸球菌的存在與根尖病持續感染關系密切。

Siqueira等設計了應用特異性探針檢測牙髓感染異性細菌存在的實驗，分別于2001年、2003年檢測到牙髓感染中的產黑色素菌、福賽斯擬桿菌、丙酸丙酸鹽桿菌及伴放線放線桿菌的存在。

3　構建16S　rDNA克隆文庫

Schirrmeister等對于已經進行根管充填卻長期伴有慢性根尖病損的患牙進行了細菌組成的鑒定后發現，在18例患牙中有10例存在復雜的微生物環境，大部分的陽性患牙由2～8個菌種混合而成，另有2例患牙只檢測到糞腸球菌的存在。并首次在根管中檢測到河流漫游球菌。Solobac-terium　moorei和具核梭桿菌是最常見的兩個菌種，在陽性的7例患牙中，有5例表現為兩個菌種的出現具有相關性。另有研究發現，在出現微小微單胞菌和難見戴阿利斯特桿菌的樣本中，均可以檢測到Solobacterium　moorei和具核梭桿菌的存在。

Subramanian等對已切除的34例持續性根尖周炎的根尖及其周圍的炎癥組織樣本進行了實時定量PCR檢測，并對其中16例進行了16S　rDNA克隆測序，得出以下結論：1）切除的根尖樣本中細菌的總量遠遠高于根尖周炎癥組織中的細菌總量；2）根尖樣本中含有大量尚未培養的細菌。糞腸球菌及洋蔥布克菌在所有樣本中占主導地位；纖細彎曲菌和格氏鏈球菌多見于根尖樣本；牙縫奇異菌、微小消化鏈球菌屬、鏈球菌屬C8、小桿菌屬E2_20　E1及真菌菌株A35MT多見于根尖周組織樣本。

由此可見，采用構建16S　rDNA克隆文庫的方法所測得的菌群較為全面，敏感性和特異性均較高；但該方法工作量較大，費用高，研究樣本量較少。此外，使用該方法分析環境微生物菌群還受到目前基因文庫庫容量的影響。Kemp等運用多種統計學方法分析比較了文獻報道的225個來自多種環境的16S　rDNA文庫的組成，發現隨著庫容量的增大，菌群分類單位總是在增加，這一結果說明幾乎沒有哪一個文庫可以完全包括樣品中多樣性的微生物種類；而且這種實驗方法存在16S　rDNA通用引物特異性較差以及PCR過程中高濃度模板競爭等問題，導致一些豐度小的菌種可能無法被檢測出。

4　核酸雜交及相關技術

4.1基因芯片技術

基因芯片的工作原理與經典的核酸分子雜交一致，利用已知核酸序列作為探針與互補的靶核苷酸序列雜交，通過隨后的信號檢測進行定性與半定量的分析。

Rocas等利用基因芯片技術檢測持續性根尖周炎患者根管內的微生物群，選取了28種特異性探針與感染根管內細菌擴增產物進行雜交，鏈球菌屬的檢出率為47％，乳桿菌屬的為35％，小類桿菌屬的為29％，其中8個菌屬菌量大于105，其中鏈球菌和齒垢密螺旋體最為常見。特異性探針擴增糞腸球菌及白色假絲酵母菌的陽性率分別為47％和6％。感染多為混合感染，即使檢出糞腸球菌的存在，其也不一定是感染的優勢菌。

由于采樣方法可能造成細菌種類和總量的誤差，Rocas等研究了已拔除的無法保留的持續性根尖周炎患牙，將牙根分切為根尖1／2和根管上段1／2，進行低溫下研磨并提取總DNA進行了同樣的雜交檢測，實驗同樣選用28種特異性探針，檢出率分別是：牙齦歐氏菌（76.5％）、保氏普雷沃菌（71％）、牙髓卟啉單胞菌（65％）、具核梭桿菌（53％）、福賽斯坦納菌（47％）。其中，牙齦歐氏菌、牙髓卟啉單胞菌及痤瘡丙酸桿菌在根尖區更為常見，保氏普雷沃菌、福賽斯坦納菌和具核梭桿菌在根尖段及根管上段的檢出率并無差異，而鏈球菌屬在根管上段的檢出率則較高。

DeSantis等利用含297851個16S　rDNA探針的高密度芯片對3種環境樣本的微生物種類進行了分析，并與傳統的16S　rDNA克隆測序方法進行了比較，結果表明，芯片技術雖然不能鑒定新菌種，但在分析環境樣本時比克隆測序方法獲得了更多的生物多樣性信息。

4.2熒光原位雜交技術及流式細胞技術

熒光原位雜交技術是一種不依賴PCR的分子分析技術，它利用帶熒光標記的特異性核酸探針與靶序列雜交，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號來確定靶序列分布的方法。它結合了分子生物學的精確性和顯微鏡的可視性信息，可以在自然的微生物環境中檢測鑒定微生物個體，并對微生物群落進行評價，目前已應用到腸道微生物菌群的研究中。Colombo等通過原位雜交結合激光共聚焦顯微鏡觀察健康成人與慢性牙周炎患者牙齦上皮內細菌聚集情況，發現牙周炎患者牙齦上皮細胞內細菌聚集量顯著高于健康成人；但熒光原位雜交技術存在樣本自身產生熒光、探針特異性不足等缺點，所以需要結合其他分子生物學技術才能得到更多有用的信息。

流式細胞技術（flow　cytometry，FCM）是以高能量激光照射高速流動狀態下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產生的散射光和發射熒光的強度，從而對細胞各類性狀及功能狀態等進行定性或定量檢測的一種現代細胞分析技術，可根據發射光的熒光強度和波長將發光顆粒亞群分開并可實現單克隆分選。

用FCM進行DNA指紋圖譜分析是快速鑒別和診斷細菌的一種新方法。該法將限制性片段長度多態性分析與FCM相結合，具有快速、可靠性好等優點，利于檢測新出現的未知菌。

分子生物學的實驗方法將人們的視野擴展到了不可感知的領域，它的高度敏感性、特異性，操作的標準化、規范化，使人們從依靠培養進行實驗的時代大大跨越了一步。人們可以檢出更多種的細菌，并可以對其進行定量研究，但是在研究個別可疑致病菌的致病機制的同時，也要注重菌群之間的相互作用，以及從生態學角度分析菌群的組成，回歸到它們的整體作用上來，進而全面了解疾病進程并為實施有效的干預提供幫助。

篇7

2002年召開的《生物多樣性公約》第六次締約方大會上通過的VI/7A號決定，要求各締約方制定關于把與生物多樣性相關問題納入環境影響評估及戰略環境評估立法或進程的準則[1]。2006年召開的《生物多樣性公約》第八次締約方大會上通過了“關于涵蓋生物多樣性各個方面的影響評估的自愿性準則”的第VIII/28號決定[2]。我國是最早簽署《生物多樣性公約》的國家之一，政府積極采取措施履行公約規定的義務。2003年9月1日起施行《中華人民共和國環境影響評價法》（以下簡稱《環評法》），首次提出對規劃進行環境影響評價。要求“國務院有關部門、設區的市級以上地方人民政府及其有關部門，對其組織編制的土地利用的有關規劃，區域、流域、海域的建設、開發利用規劃，應當在規劃編制過程中組織進行環境影響評價，編寫該規劃有關環境影響的篇章或者說明”；“對工業、農業、畜牧業、林業、能源、水利、交通、城市建設、旅游、自然資源開發的有關專項規劃，應當在該專項規劃草案上報審批前，組織進行環境影響評價，并向審批該專項規劃的機關提出環境影響報告書”。這就意味著國家正式把針對規劃的戰略環境評價放在了重要位置[3]。2009年10月1日起施行的《規劃環境影響評價條例》（以下簡稱《條例》），是在《環評法》的法律框架下，從規范管理的角度出發，對法律不明確之處予以明確，對法律的原則規定予以細化，通過進一步完善規劃環評程序，明確實施主體，落實相關方的法律責任、權力和義務。《條例》的出臺，表明國家對規劃環境影響評價的執法力度將進一步加強[4]。其中直接歸屬農業部門的有農業、畜牧業專項規劃，涉農的有土地、區域、流域、海域等有關規劃。2010年9月環保部發文“中國生物多樣性保護戰略與行動計劃（2011—2030年）”，在條目五“生物多樣性保護優先領域與行動”中設立優先領域二“將生物多樣性保護納入部門和區域規劃，促進持續利用”，要求“開展生物多樣性影響評價試點”[5]。我國是生物多樣性大國，生物多樣性居世界第八位。我國又是世界上人口最多、約85%左右的人口在農村的農業大國，對生物多樣性具有很強的依賴性。農業部門制定的農業規劃以及其他部門制定的涉農規劃，絕大部分是在農區實施的。農區是由原本豐富多樣的生物地理就界開發而來，農區邊際土地仍然是生物多樣性相對富集的區域，農區生物多樣性也是國家生物多樣性的重要組成部分。開展農業規劃環評生物多樣性影響評價是農區生物多樣性保護與管理的基礎，也是環評不可缺少的內容。

2生物多樣性影響評價基本內涵與主要內容

2.1基本內涵

生物多樣性保護是生態和環境保護的核心內容之一，而環境影響評價是從源頭保護生物多樣性的重要途徑。農業規劃環評中生物多樣性影響評價的基本內涵就是：農業規劃實施對規劃區域的遺傳多樣性、物種多樣性、生態系統多樣性和景觀多樣性可能帶來的影響進行分析、預測與評估，提出避免、預防或減輕不良影響的對策和措施，建立監測機制并跟蹤評價，持續改進達到保護目的。

2.2主要內容

農業規劃生物多樣性影響評價的主要內容有4方面：

（1）分析預測規劃實施可能會影響到實施區域生物多樣性的哪些方面。關于生物多樣性影響評價的分析尺度，目前比較公認的是遺傳多樣性、物種多樣性、生態系統多樣性。隨著景觀生態學的發展，將景觀生物多樣性納入生物多樣性保護的層次；

（2）對影響可能造成的后果加以評價包括短期影響、長期影響、直接影響、間接影響、累積影響等，影響是否有利，是否可恢復等。

（3）針對生物多樣性各層次的影響，需要采取哪些預防和保護措施；

（4）建立長期監測生物多樣性的機制，跟蹤和預測生物多樣性的變化趨勢。

3農業規劃環境影響評價中生物多樣性影響評價基本程序

根據農業規劃環評中生物多樣性影響評價的基本內涵，其基本程序包括規劃分析、現狀調查與分析、影響要素識別、影響預測與評價、預防和保護措施、監測與跟蹤評價等。

3.1規劃分析

規劃分析首先是規劃的協調性分析，規劃協調性分析可以幫助了解規劃政策背景[6]，分析規劃與相關政策法規的一致性、與產業政策的符合性、與國家及地方有關規劃的符合性，同時避免不同部門、不同層次間規劃缺少銜接以及沖突[7]。包括外部協調性分析和內部協調性分析。外部協調性主要是分析規劃目標的合理性與限制性，內部協調性是分析規劃界定的主要內容之間是否存在沖突等。其次是分析規劃的有關內容，包括規劃的編制背景、規劃的目標、規劃的對象、規劃的具體內容、實施方案、實施范圍、實施期限等。第三是分析規劃的不確定性[8]。各級政府和部門編制的規劃其協調與銜接狀況對規劃的實施具有不確定性、規劃本身的遠期不確定性、規劃的具體項目的不確定性、污染物排放量的不確定性等。

3.2現狀調查與分析

根據生物多樣性的層次及保護需要，調查農業規劃實施區域生物多樣性歷史演替過程和現狀。重點調查分析以下區域的生物多樣性：（1）具有生態學意義的保護目標；（2）具有美學意義的保護目標；（3）具有科學文化意義的保護目標；（4）具有經濟價值的保護目標；（5）重要生態功能區和具有社會安全意義的保護目標；（6）生態脆弱區；（7）人類建立的各種具有生態環境保護意義的對象等[9]。

3.3影響識別、預測與評估

生物多樣性影響識別是在分析農業規劃目標及總體方案的基礎上，通過一定方法找出農業規劃所確定的某個項目或活動對生物多樣性影響的各種變化指標，說明生物多樣性影響的性質、程度及可能的影響范圍。影響識別主要包括以下3方面：（1）影響主體識別。識別農業規劃的目標、指標和總體方案及其執行主體，主要是可能給生物多樣性帶來影響的農業規劃活動等具體的規劃實施內容以及這些規劃實施內容具體的執行主體。（2）影響受體識別。識別規劃區域內主要的生物多樣性資源：包括遺傳多樣性與重要農業種質資源、物種與生境多樣性、生態系統多樣性，如自然保護區、風景名勝區、濕地、農田、水土流失重點治理區等的組成結構、面積和分布等；景觀多樣性，包括景觀類型多樣性、斑塊多樣性、景觀異質性和穩定性等。特別應了解該區域農業生產活動的歷史與現狀、是否產生過或者現在仍然存在一些嚴重的生態問題，因為這些生態問題往往與生物多樣性直接相關。（3）影響效應識別。識別主體（農業規劃）與受體（生物多樣性）的相互關系，確定農業規劃對生物多樣性的顯著影響及關鍵影響因子。對生物多樣性影響的強度，關注影響發生的背景。影響強度包括影響范圍、影響過程和影響性質（包括有利/不利、可逆/不可逆）；影響發生的背景包括產生地點、影響時間以及受影響者的具體情況。在上述影響識別的基礎上，結合規劃的總體目標及在不同的階段或期限予以實施的情況，預測規劃實施的不同階段或期限可能造成的生物多樣性影響并進行評估。

3.4預防措施與保護方案

由于農業規劃實施范圍較大，具有宏觀性，規劃環境影響評價的生物多樣性保護也需從大的范圍和宏觀上進行把握。制定具體的預防措施和保護方案，應依次按照預防措施、最小化措施、減量化措施、修復補救措施、重建措施序列原則進行[9]。物種及其生境（棲息地）是各層次生物多樣性表現形式和基礎，對于重要物種的保護要以就地保護為主，遷地保護為輔。物種與其生境具有不可分割的聯系，保護原生境及其里面的生物資源是保護生物多樣性及其資源永存的最符合自然規律的手段，也是“生態系統方法”的基本原理之一。遷地保護措施也很重要，但它是在原生境遭到嚴重破壞和就地保護已經不可靠的情況下的輔助手段。

3.5監測與跟蹤評價

由于生物多樣性影響的表現具有滯后性特點，應建立長期監測機制，對生物多樣性保護目標動態變化進行跟蹤監測，分析生物多樣性變化的趨勢，預防可能產生不良影響的因素，及時調整保護措施，確保生物多樣性保護的有效性。

4農區生物多樣性影響評價層次及特點

農業是一種直接利用生物多樣性的產業，包括直接利用生物多樣性的資源材料以及模擬生態系統的初級生產（植物種植業）和次級生產（動物養殖業）等全部生產過程；而且還包括進一步利用生態系統中的有機物腐解過程使之轉化為農業經濟作物（食用菌養殖、微生物造肥、生產沼氣等）。考慮到農業規劃主要是在農區實施，這里的農區不是僅局限于種植業區域的“小農區”，是包括農牧漁業生產活動范圍的“大農區”，因此，就農區和農業而言，生物多樣性可分為農區遺傳多樣性、農區物種及生境多樣性、農區生態系統多樣性、農區景觀多樣性、農業產業結構多樣性幾個尺度水平[10-11]。

4.1農區遺傳多樣性影響評價特點

遺傳多樣性是生物多樣性的基本組成部分，是物種多樣性和生態系統多樣性的基礎。它通常被認為是種內不同群體之間和一個群體內不同個體之間的遺傳變異總和。遺傳多樣性是以物種為載體表現的，可以從形態特征、生理特征、細胞學特征、基因位點及DNA序列等不同方面來體現。農區遺傳多樣性影響評價應主要關注：

（1）農業活動使得生境破碎、消失引起物種種群縮小、消失導致遺傳多樣性喪失；

（2）外來物種入侵排擠當地種，使得遺傳多樣性喪失；

（3）農業新品種發展項目，對遺傳多樣性產生的影響；

（4）轉基因作物可能引起的遺傳多樣性的變化及喪失[12]。由于受科學研究的限制，在現實中只對少量的物種進行過比較全面的遺傳多樣性研究，在遺傳多樣性層次評估生物多樣性影響目前還不具有普遍意義。在環評工作中，建議把遺傳多樣性影響評價的內容與物種多樣性、生態多樣性影響評價融合在一起描述，更易于操作。

4.2農區物種及生境多樣性影響評價特點

在我國幾千年的農業栽培和養殖實踐過程中，培育了大量食用與經濟性能優良的作物、果樹、家禽、家畜。我國栽培作物種和亞種有600多個，其中已知約237種為我國自古以來的土生栽培種，位居世界前列，被認為是世界三大農業起源中心之一。其中糧食作物30多種，蔬菜200多種，牧草與飼料作物約400多種。果樹約300種，茶品種600多個，桑有15個種，共1000多個品種。家養動物品種和類群包括特種經濟動物和家養昆蟲在內，品種和類群有2000多個。除了農業經濟物種外，在農田、湖泊與河流等濕地生態系統及荒山草坡生態系統中還有大量野生動植物物種和類群。稻田中野生動物主要以兩棲類、爬行類動物和某些鳥類為主；重要雜草約有200多種。旱地生態系統中也生長著豐富的農作物伴生物種，如有記錄的農田雜草有73科、560多種，對農作物有害的動物與昆蟲約1300多種，天敵生物近2000種，其中僅棉田的重要天敵蜘蛛就有21科、89屬、205種[11]。這些構成了我國農區物種及生境多樣性。在環評實際工作中，對農業規劃實施區域內的物種及生境的全部評價是不現實的，也不符合農業規劃環評宏觀性的特點。在滿足農區生物多樣性保護要求下，物種及生境多樣性影響評價應針對區域關鍵物種及生境進行重點評價。

（1）保護物種。被國際、國家、地方、部門或保護組織明確列入保護名錄的物種。主要評價保護物種分布狀態、種群結構及現存數量、保護級別、瀕危程度、生境特點、對環境的敏感程度、農業規劃實施對保護物種的影響程度、就地保護和遷地保。護實施的可行性等；

（2）地方特有種。其分布范圍狹窄、生境條件苛刻，當分布的區域環境改變，有可能造成這些物種滅絕。主要評價特有種的特有性（國際特有、國家特有、地方特有、區域特有）、瀕危程度、生境特殊性、受影響程度、就地保護和遷地保護實施的難易程度等；

（3）重要的農業種質資源。是我國農業生產活動的基礎，關注其受保護的狀態，受影響程度，入庫保存情況；

（4）栽培和家養生物的野生近緣種和野生類型。起源于我國的栽培作物不僅種類多，而且具有野生近緣種的也多，它們是農業生物多樣性的寶貴遺傳資源；家養生物的野生型是潛在進行品種改良的重要遺傳資源。這些遺傳資源的價值難以估量，在評價中應重點確認這些物種的存在、數量、生境條件、瀕危程度、受影響和潛在影響程度、保護措施等；

（5）其他物種，規劃實施區域受到較多關注的物種，具有文化及文物特點的物種等。

4.3農區生態系統多樣性影響評價特點

我國農區生態系統按其基本類型可以分為6類：農田（水田與旱地）生態系統、種植園（水果、干果、蔬菜、茶葉、桑、藥材、花卉和其他特殊經濟作物）生態系統、草原與草地生態系統、水產水域生態系統（陸地水域和海洋水域，與濕地生態系統基本類同）、集約化養殖場系統和農區邊際土地生態系統[11]。農業規劃實施不確定性的特征，在對農區生態系統多樣性影響的質（影響性質、影響類型、影響因素）和量（影響程度、時空規律、發生概率）上有更多不確定性。農區生態系統多樣性影響評價主要是：

（1）生態系統類型結構和功能完整性；

（2）生態系統的脆弱性和整體變化趨勢；

（3）生態系統的服務功能及生態承載力；

（4）農業規劃實施可能的影響方式、范圍、強度和持續時間；

（5）受影響強度、范圍和持續時間，影響的結果是否有利、是否可逆；

（6）生態系統抗干擾的能力、恢復能力和生態系統的功能維系；

（7）預防與保護措施實施的可行性。

4.4農區景觀多樣性影響評價特點

景觀多樣性是繼遺傳多樣性、物種多樣性、生態系統多樣性被提出的生物多樣性研究的第四個主要層次。這4個層次之間的關系依次為遺傳多樣性產生了物種的多樣性，物種多樣性與生境多樣性構成了生態系統的多樣性，多樣性的生態系統聚合并相互作用又構成了景觀的多樣性。農區景觀范圍多指大農業或是整個農業區域，因此對具有戰略定位的農業規劃進行景觀多樣性影響評價是非常重要的。農業規劃實施對農區景觀多樣性影響，主要關注（1）對景觀類型多樣性影響，景觀類型的分布面積和空間結構等發生明顯變化、影響強度、指標物種瀕危程度、變化是否可恢復；（2）對景觀斑塊多樣性影響，鑲嵌地塊間生境的異質性、連通性是影響生物多樣性的重要因素。農區殘存的非農作性生境，包括農田邊際土地、島狀野生生境、灌木帶、林地、水塘、溝渠、荒地和休耕地等受影響的程度，這些生境破碎化程度，影響強度是否可逆；（3）對景觀格局多樣性影響，地塊內物種的異質性和共生性影響物種多樣性豐富程度。農業活動方式變化、人為干擾強度、外源性物質流入（農用化學品等）、外源性遺傳物質入侵（轉基因種植、外來物種入侵等）的影響。

4.5農業產業結構多樣性評價特點

農業產業結構多樣性用以描述包括農、林、牧、副、漁各業的組成比例與結構變化，它反映著某一區域農業生產的總體狀況，這也是農業規劃中重要的篇章。應重點分析農業規劃實施區域規劃實施前后，農、林、牧、副、漁各業的組成比例與結構可能產生的變化，這一變化對當地生物多樣性可能產生的影響，分析影響的范圍、強度持續時間、是否有利、是否可逆等，重點評估當地生物多樣性變化可能帶來的經濟價值變化。

篇8

關鍵詞：黃瓜；輪作；大蔥；土壤；連作障礙

中圖分類號：S642.2 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.008

研究表明，蔬菜連作會導致生長受阻，抗病能力減弱，產品產量和品質下降[1-2]。連作土壤與輪作土壤相比，理化性質變劣[3]，酶活性降低[4]，微生物數目及種群多樣性減少[5]。黃瓜是設施主栽蔬菜，連作障礙已成為制約其高產高效和可持續發展的重要因素。試驗發現，大蔥輪作可顯著減輕黃瓜連作土壤障礙，促進生長，提高產量[6]，對此，前人從根區土壤的理化和生物學特性方面進行了探討[6-8]。根際是植物與土壤進行物質和能量交換最劇烈的區域，根際土壤的理化和生物學特性與非根際土壤明顯不同[9]。本試驗以黃瓜連作土壤為對象，比較研究了大蔥-黃瓜輪作和黃瓜-黃瓜連作兩種栽培模式對后茬黃瓜根際土壤理化和生物學性狀的影響，以期探討大蔥輪作減輕黃瓜連作障礙的機理，為制定合理栽培制度提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試土壤取自山東省泰安市岱岳區房村鎮北滕村，為連續種植15年黃瓜的日光溫室耕層土壤。土壤類型為棕壤，屬砂壤土，土壤理化性狀為pH 值6.19，EC值 825 μS·cm-1，堿解氮238.0 mg·kg-1，有效磷151.2 mg·kg-1，速效鉀131.2mg·kg-1。

供試黃瓜（Cucumis sativus L.）品種‘新津11號’，大蔥（Allium fistulosum L.）品種‘元藏大蔥’。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計 試驗于2011年8月—2012年6月在山東農業大學園藝試驗站日光溫室內進行，設2個處理：大蔥-黃瓜輪作（T），黃瓜-黃瓜連作（CK）。每處理30盆，隨機排放。花盆直徑30 cm，高25 cm，內裝連作土壤10 kg。裝盆前向土壤中均勻混入復合肥（N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15）10 g，生育期不再追肥。黃瓜、大蔥分期播種育苗，2011年8月29日同時定植，黃瓜每盆1株，大蔥每盆5株，12月20日拉秧。

后茬于2012年4月25日全部定植黃瓜，常規方法管理，6月20日拉秧。

分別于5月15日、5月25日、6月5日取樣。每處理隨機取5盆，利用雷娟利等[10]方法獲得根際土樣，混合均勻，研磨過2 mm篩，一部分于4 ℃冰箱保存，用于土壤微生物分析；另一部分風干后過1 mm篩，用于土壤酶和理化指標分析。

1.2.2 測定方法

（1）土壤理化性狀。pH值按土水比1∶5（W/V）浸提，用雷磁PHBJ-260便攜式pH計測定，EC值按土水比1∶5（W/V）浸提，用雷磁DDB-303A便攜式電導率儀測定；堿解氮采用堿解擴散法測定，有效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定，速效鉀采用醋酸銨浸提-火焰光度法測定[11]。

（2）土壤微生物數量。細菌采用牛肉膏蛋白胨培養基培養；放線菌采用改良高氏1號培養基培養（每1 000 mL培養基中加入3%重鉻酸鉀3.3 mL）；真菌采用馬丁氏培養基培養（每1 000 mL培養基中加入1%孟加拉紅水溶液3.3 mL，1%鏈霉素3 mL）。微生物數量均采用系列稀釋法計數[12]。

（3） 土壤酶活性。土壤脲酶采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定；磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測定；過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法測定[13]。

1.2.3 數據統計與分析 采用DPS軟件對數據進行方差分析及最小顯著差異性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同種植模式對黃瓜根際土壤EC值和pH值的影響

伴隨生育期推進，黃瓜根際土壤EC值不斷降低，生育初期輪作黃瓜的根際土壤EC值大于連作黃瓜，但定植40 d后，EC值開始低于連作黃瓜（圖1）。連作和輪作黃瓜根際土壤pH值緩慢升高，輪作黃瓜上升幅度大于連作黃瓜，6月5日輪作黃瓜的根際土壤pH值高于連作黃瓜土壤。

2.2 不同種植模式對黃瓜根際土壤養分含量的影響

由圖2可以看出，根際土中速效氮含量呈先升高后降低趨勢，有效磷和速效鉀含量則持續降低。生育初期，輪作黃瓜根際土壤中的速效氮、有效磷、速效鉀含量高于連作土壤，盡管有效磷含量未達顯著差異水平，說明前茬大蔥吸收的養分較少。隨著植株生長，輪作黃瓜根際土壤中有效磷含量迅速降低，以致低于連作土壤，速效氮與連作土壤無顯著差異，速效鉀含量卻始終較高。

2.3 不同種植模式對黃瓜根際土壤酶活性的影響

脲酶是土壤中主要的水解酶之一，與土壤中尿素的水解密切相關，其酶促產物氨是植物氮源之一；磷酸酶可加速有機磷的脫磷速度，對土壤磷素的有效性具有重要作用，其活性是評價土壤磷素生物轉化方向與強度的指標；過氧化氫酶促過氧化氫的分解，有利于防止它對生物體的毒害作用，其活性則可以反應土壤中氧化過程的強度[13]。根際土壤中3種酶活性均隨黃瓜生長不斷升高，但輪作黃瓜根際土壤酶活性始終高于連作土壤（圖3），6月5日輪作土壤中脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶活性分別是輪作土壤的1.24，1.11，1.27倍，說明輪作有利于提高后茬黃瓜根際土壤酶活性。

2.4 不同種植模式對黃瓜根際土壤微生物群落結構的影響

從圖4可以看出，隨著黃瓜的生長，根際土中細菌、真菌和放線菌數目均不斷增加，其中，細菌在土壤微生物群落中占絕對優勢。根際土壤中細菌、放線菌和真菌數初期差異不大，后期輪作黃瓜根際土壤中細菌、放線菌數目顯著高于連作黃瓜，真菌數則顯著低于連作黃瓜。輪作黃瓜根際土壤中真菌數占微生物總量的比例低于連作黃瓜，6月5日土壤真菌所占比例分別為0.28%和0.54%。

3 討 論

設施連作障礙的一個重要原因是土壤酸化、次生鹽漬化和養分失衡[14]。合理輪作可以降低土壤鹽分積累，在一定程度上避免次生鹽漬化的發生[15]。與連作相比，輪作黃瓜的根際土壤EC值降低速度較大，最后低于連作黃瓜根際土壤，可能與輪作植株生長勢較強，吸收土壤中養分較多有關。王柳[16]發現，在不施肥或只施底肥情況下，黃瓜根區土壤pH值總體呈上升趨勢。本試驗中，伴隨黃瓜生育，連作和輪作黃瓜根際土壤pH值均呈升高趨勢，可能與只施用了底肥有關。

輪作黃瓜根際土壤中速效氮、有效磷和速效鉀含量前期較高，說明前茬大蔥吸收養分數量少于黃瓜。伴隨生育進程，黃瓜根際土壤中養分含量快速降低，輪作黃瓜根際有效磷含量低于連作黃瓜，可能因為輪作黃瓜生長旺盛，對磷的吸收較多，同時磷在土壤中移動性較差[17]有關。土壤速效氮含量先升高后降低，可能由于根系生理活動使速效氮在根際發生了富集。欽繩武等[18] 對氮素在根際遷移規律的研究中發現，氮素在旱作根際土壤中會出現富集現象。

土壤酶直接參與土壤中物質的轉化及養分的釋放和固定過程， 與土壤肥力狀況密切相關[19]。本試驗中，大蔥輪作模式下土壤酶活性明顯高于黃瓜連作土壤。吳煥濤等[6]也得出相似的結論。土壤酶活性升高是輪作減輕連作障礙的原因之一。

土壤微生物群落結構的多樣與穩定不僅可提高土壤微生態的穩定性，也可提高土壤的緩沖能力[20]。本研究結果表明，輪作黃瓜根際土壤中可培養細菌及放線菌數目均高于連作黃瓜，可培養真菌數目則低于連作黃瓜，與楊鳳娟[8]、吳鳳芝[21]研究結果一致，表明輪作可以改變土壤微生物群落結構，改善土壤的微生態環境。

本試驗結果表明，大蔥輪作后的黃瓜根際土壤理化及生物學性狀得到明顯改善，可作為防控設施黃瓜連作障礙的一種有效種植模式。

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篇9

自可持續發展理念提出以來，人們越來越重視對生態自然環境的保護。其中，林業的發展為社會經濟發展提供所需要的木材。然而，由于不加節制的開采，造成對森林生態環境的破壞。為此，退耕還林政策的實施對于改善生態環境具有重要作用。本文主要研究退耕還林的基本內涵與需要遵循的原則，且深入地研究退耕還林在改善生態環境方面發揮的作用，旨在推動我國社會經濟健康可持續發展。

關鍵詞：

退耕還林；改善生態環境；作用；研究

環境是人們賴以生存的基本條件，自然環境質量的好壞，直接影響著人們的生活與經濟發展質量。然而，在經濟快速發展的同時，向自然界索取大量的林木資源，造成對生態環境不同程度的破壞。為此，通過采取退耕還林的政策，對我國生態環境加以改善，不僅是貫徹落實科學發展觀的必然要求，更是踐行可持續發展理念的重大舉措。

一、退耕還林的內涵

按照我國林業局對于退耕還林所作出的定義可以得知，退耕還林的創立與實施以多個角度為出發點。就環境保護方面而言，通過退耕還林的實施，有步驟性、計劃性地改善荒漠化與水土流失嚴重地區。在加強對自然生態環境保護的同時，更將以各個地區的特點為出發點，適當地種植多樣性的植被，對于恢復原有植被以及保護生物多樣性都具有重要作用。退耕還林政策實施的過程是一個兼具科學性與系統性的過程。具體表現為以下兩個方面：一方面是采取有效的措施以改善存在水土流失問題的地區，相應地增加多樣性植被的種植；另一方面，通過造林方式對荒漠山地加以改造。因此，退耕還林政策的實施，既可以改善生態環境，又可以推動經濟發展，兼顧好經濟效益與生態效益，在滿足社會發展需求的同時，加強對生態自然環境的保護，是造福人類的重大舉措。

二、退耕還林的原則

在實施退耕還林的過程中，應當嚴格地遵循以下幾點原則，從而實現對生態環境的改善。第一，在改善生態環境時，應當以綜合性發展目標為指導，相應地確立合理的實施目標，在推動與促進社會經濟建設發展的同時，應當有效地利用好經濟變化、資源變化與環境變化；第二，退耕還林政策實施過程中應堅持因地制宜原則，根據各個地區的發展條件與變化因素等，充分地考慮各地區在改善與發展過程中所形成的環境狀況的差異性，相應地找出合適的解決方案。為此，相關人員在實施退耕還林之前，應當深入地分析該地區的實際情況與變化因素，合理地實施有效的對策，既要做到因地制宜，又要達到優化生態環境質量的目標；第三，重視植被的多樣性，在退耕還林政策實施之前，應當確立明確的改善目標，切實做好防風固沙以及防止水土流失等工作，實現改善生態環境的目的；第四，在實施退耕還林政策時，應當充分地考慮當地的經濟發展狀況，正確地處理好經濟效益與生態效益兩者之間的關系，實現兩者的相互統一；第五，在退耕還林政策實施過程中，不僅要對生態環境變化加以改善，而且應該對該地區的農業產業結構加以完善，進一步地優化農業產業結構，推動促進經濟的發展。如通過挖掘區域的景觀優勢，大力發展特色旅游業，提升產業結構的多樣性，促進生態效益與經濟效益兩者相互協調發展等。

三、退耕還林對改善生態環境的作用

1加強對水土流失的控制

通常情況下，在未實施退耕還林以前，多數陡坡耕地種植條件惡劣，在雨水以及地表水的沖刷作用下，極容易引發水土流失的問題，石漠化現象嚴重。通過對大部分陡坡耕地進行造林綠化，生態環境不斷改善。新種植的地表植被通過發達的根系固定土壤，枯落物逐年累積，降低了地表水的沖刷力度，從而實現對水土流失的有效控制。

2恢復植被多樣性

在實施退耕還林政策之前，地表的植被非常稀疏，植被樣式以雜草與莊稼為主，種類非常單一。通過退耕還林喬-灌-草結合的多層次立體結構種植，退耕地植物種類豐富各異，不僅科學合理地實現了地表植被的多樣性發展，使群落環境相對穩定，最大程度地發揮了生態效益。

3改善空氣的質量

在退耕還林政策實施之后，種植了多種植物配置模式的地表植被，成片的森林減少了沙塵天氣的發生，降低了危害。種類豐富的植物能夠吸收大氣中的二氧化碳并釋放氧氣，對生態系統及大氣平衡有著重要的意義。林草植被達到一定面積后，對區域內小氣候的影響較為顯著，森林在蒸騰作用下，能夠降低氣溫，提高地面濕度，甚至增加降雨，逐漸改善區域生態環境。

4改善土壤的性質

退耕還林實施后，地表累積逐漸增厚的枯落物層形成了天然的保護，有效地截留降雨、減少雨水對地表的侵蝕，減弱了雨水對地表的直接作用。同時枯落物經過微生物分解作用釋放有機物，土壤有機質含量增加，土壤質量得到提高、土壤結構得到優化，增強了土壤抵抗沖擊、侵蝕以及自我修復的能力。

5旱澇災害的緩解

在退耕還林政策實施之前，不僅地表植被覆蓋率較低，而且存在嚴重的水土流失問題，甚至會造成河流阻塞以及引發旱澇災害等。在退耕還林政策實施之后，通過增加地表植被，有效地固定土壤，減少了地表徑流對土壤的侵蝕，緩解江河湖庫的泥沙淤積，從而實現對洪澇災害的有效控制。同時，通過森林植被對小氣候的改善，地面附近降溫增濕，降低了干旱威脅程度。因此，退耕還林政策的實施，是減輕旱澇災害的重要方式。

6提升生物的多樣性

在實施退耕還林政策之前，地表植被較少，缺乏多種生物的生存空間，耕地環境中生物物種也相對單一。退耕還林實施之后，為動物的棲息和繁衍增加了更多空間的同時，也為微生物提供了就地保護的良好場所，對于保護生物的多樣性、維持生態環境穩定具有重要意義。結語：綜上所述，退耕還林政策的實施，在增加森林覆蓋率的同時，減少水土流失，進一步地改善區域小氣候，達到凈化空氣、改善環境的效果。因此，應當重視退耕還林政策實施，這為自然生態環境的質量提供了重要保障。

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關鍵詞 喀斯特；貴州；白三葉；同一花序；形態多樣性

中圖分類號 S651 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2537（2016）05-0038-06

Abstract By observing the shape index of 19 wild Trifolium repens， we compared the morphological diversity of the same inflorescence at different altitudes. Our results imply that the morphological diversity of 19 wild Trifolium repens on the same inflorescence at different altitudes has a markedly difference. The total coefficient variation of all above indices obeys the following order： leaf area>above-ground biomass>stolon length>growing point>height >leaf length>leaf width> growth habit>V shape stripe. Between different altitudes in Trifolium repens form shape in the group have difference degrees of variations. The clustering analysis found little correlation with the altitude origin.

Key words Karst region； Guizhou； Trifolium repens； the same inflorescence； morphological diversity

基因漂移、遺傳漂變、遺傳瓶頸、自然選擇和地方適應性等因素，可以通過在不同時空尺度上的動態變化來影響并改變生物適應性和多樣化的進程[1].目前，花粉污染、基因漂移等問題已經在實驗中得到普遍證實，而大部分研究只是針對一些基礎性工作，如花粉傳播因素、基因漂移距離、雜交親和性等[2-5].空間分離群體之間的隔離和基因流動的程度決定了遺傳差異、生殖隔離和物種形成的潛在能力.遺傳漂變和自然選擇都會使群體之間的差異增加，而基因流的作用會使群體之間的差異減小[5].研究同一花序水平上植物形態多樣性，可以減少以上因素的影響，使其表型性狀與其生態適應性的研究更趨于一致.

白三葉（Trifolium repens L.）是多年生草本優質牧草，屬異化授粉植物，廣泛分布于世界各地，在農牧業中地位重要.貴州是中國發育最典型的喀斯特地貌之一，不僅地勢起伏大、切割強、相對高度常達到300～700 m，且喀斯特廣泛發育，地貌類型較復雜.其次，貴州具有高原峽谷地貌結構特征，導致水土資源分布不平衡，形成了多種特殊的生態位.白三葉在長期的演化過程中，不斷向著適應其生境的方向進化.本研究收集貴州省境內19份白三葉種質為試驗材料，比較其不同海拔高度居群間和同一花序水平上的多樣性，為下一步選育優質高效白三葉新品種提供指導.

1 材料和方法

1.1 貴州地理與氣候

試驗在貴州貴陽市貴州牧草推廣站溫室大棚內進行，種子收集于貴州省不同海拔區域.貴州全省大部分地區氣候溫和，四季分明.全省平均氣溫的最高值出現在7月，平均22～25 ℃；最低值出現在1月，平均為4～6 ℃；年平均氣溫為14～19 ℃.全年極端最高氣溫為34.0～36.0 ℃，極端最低氣溫為-6.0～-9.0 ℃.常年雨量充沛，時空分布不均.全省各地多年平均年降水量大部分地區為1 100～1 300 mm，最大值接近1 600 mm，最小值約為850 mm.一年中的大多數雨量集中在夏季.全省大部分地區年日照1 200～1 600 h，氣候特點是垂直方向差異較大，立體氣候明顯.

1.2 材料收集

2013年5～8月在全省范圍內采集野生白三葉種子，有效樣本19份，見表1.

1.3 栽培與觀測

1.3.1 溫室栽培 2014年9月20日在貴州省牧草推廣站溫室大棚播種.從19份材料中各選取一個果實飽滿的花序，將來自同一花序的種子播入有32個小格的育苗培養盤，孔穴大小60 mm×60 mm.每小格播2粒種子，覆土1 cm，澆水.培養基質為m（石英砂）∶m（細土）∶m（腐殖質）=3∶4∶3混合而成，高壓滅菌冷卻后裝盤.待長出小苗后留選長勢較好的一株苗用于觀察研究.

1.3.2 施肥和管理 每隔3個月施復合肥1次，每次施用量0.03 kg/m2，苗期施尿素1次，使用量折合0.012 kg/m2，及時除雜草，適時澆水.

1.3.3 測量指標 2015年5月1日，參照《牧草種質資源描述規范和數據標準》[6]及前人研究方法觀測V型斑紋、葉面積、株高、中葉寬、中葉長、匍匐莖長度、生長點個數及地上生物量等指標.為便于分析，將非量化性狀特征進行標準化賦值.海拔：1=1 000 m以下，2=1 000～1 500 m，3=1 500～2 000 m，4=2 000 m以上；有無V型斑：有斑=1，無斑=2；生長習性：1=直立生長，2=匍匐分枝生長，3=匍匐不分枝生長.

1.4 數據分析

用Excel和SPSS 16.0對試驗數據進行統計，分析不同海拔高度區域白三葉種內、同一花序水平上各個性狀的差異程度.各形態變異性以變異系數CV表示，CV（%）=100×S/M（S為標準差，M為平均值）.用Person相關系數分析各個性狀之間的相關性，并對各個指標標準化后用算術平均法（UPGMA）聚類分析.

2 結果與分析

2.1 白三葉形態學分析

2.1.1 同一花序白三葉形態學性狀差異分析 同一花序水平上和不同種群間白三葉形態存在較大差異（表2）.總變異系數大于300%的有7個居群，其中W16總變異系數最大，高達429.74%，其次是W12，W1，W9，W6，W3，W10；最小的是W7，總變異系數為236.9%.各指標總變異系數從大到小為中葉面積、地上生物量、匍匐莖長度、生長點數、株高、中葉長、中葉寬、生長習性、有無“V”斑.株高變異系數最大的是W10和W18，分別為37.93%和37.51%，W2最小，只有12.63%.地上生物量變異系數最大的是W3和W1，分別為98.48%和81.67%，W14和W7的最小，為38.31%和38.55%.匍匐莖長度的變異范圍為30.95%～65.75%，變異系數最大和最小分別是W7和W3.中葉寬的變異范圍主要為10.89%～32.11%，只有居群W8的變異系數高達60.61%.中葉長的變異范圍為13.33%～32.77%，變異系數最大的為W16，最小為W7.中葉面積的總變異系數比其他指標大，其中W16，W12，W3和W6的變異系數均大于100%，最小的是W11，只有30.33%.生長習性的變異范圍為0～35.33%，其中W14，W18和W19的變異系數均為0，即這幾個居群都是匍匐分枝生長.有無“V”形斑中只有W1，W5，W11，W13和W19發生了變異，其余居群全都有“V”斑.生長點個數最大變異是W1，為64.09%，其次是W16，W9，W12和W10，最小的是W2，僅為0.75%.

2.1.2 不同海拔高度白三葉形態學數量性狀分析 不同海拔區域白三葉形態形狀居群間存在顯著差異，見表3.總體上，隨著海拔的提升，白三葉植株越來越高，生長點數越來越多，地上生物量也越來越大；而匍匐莖長度、中葉寬、中葉長和中葉面積則隨著海拔的提升而增大，高于2 000 m的區域則有所減小.在低于1 000 m的區域，匍匐莖長度的變異系數最大，高達102.87%，其次是地上生物量、中葉面積，最小的是中葉寬，僅為25.49%.在1 000～1 500 m區域，變異范圍為21.43%～80.46%，最大的為匍匐莖長度，其次是地上生物量、生長點個數、中葉面積，最小的是中葉寬.在1 500～2 000 m區域，變異范圍是21.29%～49.62%，其中變異最大的為地上生物量，其次是中葉面積，中葉寬變異最小.在大于2 000 m的區域，匍匐莖長度的變異系數最大，為61.37%，其次是地上生物量、中葉面積、株高，最小為中葉長，僅為23.21%.

2.2 形態學形狀相關性分析

白三葉的株高與地上生物量、匍匐莖長度、中葉寬、中葉長、中葉面積、生長習性及生長點數呈極顯著相關性（見表4），與有無“V”形斑和海拔高度無顯著相關；地上生物量與匍匐莖長度、中葉寬、中葉長、中葉面積及生長習性呈極顯著相關，與海拔高度呈顯著相關；匍匐莖長度與生長點數極顯著相關；中葉寬與中葉長、中葉面積、生長習性及生長點數呈極顯著相關；中葉長與中葉面積、生長點數及生長習性呈極顯著相關；中葉面積與生長習性及生長點數極顯著相關；生長習性與生長點數呈極顯著相關；生長點數與海拔呈極顯著相關性.即隨海拔的提高，地上生物量也隨之增大，生長習性有由直立生長到匍匐分枝到匍匐不分枝生長的趨勢.

2.3 基于白三葉形態性狀的聚類分析

根據貴州野生白三葉的形態鑒定數據進行聚類分析，在歐氏距離為14.5截距處，可將19份白三葉劃分為3個聚類（圖1），3個聚類性狀平均值見表5.第Ⅰ類包括8份材料，平均株高最矮，地上生物量、匍匐莖長度、中葉寬、中葉長、中葉面積和生長點數的平均值最小，只有少數無“V”形斑點；第Ⅱ類包括10份材料，其生長點數最多，其余性狀指標的平均值介于第Ⅰ、Ⅲ類之間，少數無“V”形斑點，大多是匍匐分枝生長；第Ⅲ類只有材料7（匯川區董公市鎮，987 m）獨自成一類，除匍匐莖長度最短外，生長點數介于第Ⅰ、Ⅱ類之間，全部有“V”形斑點，均匍匐分枝生長，其余形狀指標的平均值均大于第Ⅰ、Ⅱ類.由此可知，聚類分組與海拔高度沒有明顯的關系.

3 討論與結論

3.1 巖溶地區不同海拔野生白三葉同一花序形態多樣性

種質資源是生物遺傳變異和生物多樣性遺傳的物質基礎，運用形態學標記研究植物外部形態，受基因及所處生態環境的共同影響.目前，關于開花植物花序內變異原因的研究有很多[7]，有研究證明，對不同生態環境下的同種植物的形態學研究，可以了解環境對基因表達的影響[8]，而不同海拔區域帶來的環境差異會使各類昆蟲的活動受到限制或促進，導致不同海拔地區訪花者種類和訪問比例的差異[9].在同一花序水平上研究不同海拔區域白三葉表型特征，既可以減少基因漂移、花粉污染等外部影響，還可了解由海拔帶來的環境差異對其形態的影響，為下一步研究工作提供更精密的數據.本研究結果顯示，貴州19份野生白三葉同一花序水平上總變異系數大于300%的有7個居群，其中W16總變異系數最大，無論是居群內還是居群間貴州白三葉形態差異都比新疆[10]白三葉的大；各指標中總變異系數為最大的是中葉面積，其次是地上生物量、匍匐莖長度、生長點數、株高，說明其可塑性較大.貴州因地勢起伏較大，生境復雜，蘊藏著豐富的野生植物資源，例如鐘理[11]發現貴州野生匐剪股穎各形態學性狀均存在較大的變異，形態遺傳變異多產生于居群內.本研究材料采集地間海拔跨度較大，小氣候類型多樣，生境差異明顯，為適應不同的生境，白三葉在長期的進化過程中，形態性狀也隨之改變.

3.2 巖溶地區同一花序野生白三葉的多樣性與育種

在育種工作中，借助部分表型性狀及其組合，可實現對白三葉目標性狀的有效選擇.本研究中不同海拔區域甚至同一花序白三葉栽培群體內都存在較豐富的遺傳變異，可塑性較大，可為優良類型的選擇提供材料.目前，對白三葉形態農藝性狀已有較多研究，但主要集中在居群間和居群內水平上[10，12-13]，在花序水平上的研究還未見報道.目前分子生物學技術已成為植物育種研究的有效工具，如李潤芳[14]運用細胞學方法和SRAP分子標記技術對8種三葉草的種質資源遺傳多樣性進行了初步評價，張婧源[15]對來自30個國家的70份野生白三葉從表型性狀、SRAP分子標記和SSR分子標記上進行了不同產地白三葉種質資源遺傳多樣性研究.在花序水平上研究其形態多樣性，通過人工選育成的優良品種經濟性狀整齊、遺傳基因穩定.因此，對白三葉進行優良品種選育，最終建立良種繁育體系成為獲得質量穩定、可控優質白三葉的必經之路.

3.3 巖溶地區貴州野生白三葉的利用價值和開發前景

貴州地處我國云貴高原，屬長江、珠江上游地區，是我國典型喀斯特區域之一，地理位置特殊，其生態環境的優劣將直接影響整個長江、珠江流域的生態環境安全.目前，對喀斯特地區生態系統植物恢復多集中在森林生態系統的恢復研究[16]，對喀斯特山地草地相關研究還比較少[17].對貴州野生白三葉種質資源進行研究，揭示喀斯特地區白三葉種質資源豐富度、多樣性、蘊藏量等特征，可為喀斯特石漠化地區草地植被恢復提供支持.本研究通過統計分析白三葉同一花序水平上形態多樣性，發現其可塑性較大，在育種工作中可利用差異較大的材料W16和W12作為親本培育優質高效品種.還可利用白三葉進行礦山植被修復，有研究發現其能同時富集污染土壤中的銅、鎘、鉛，且富集量大[18]，是很好的礦山修復植被之一.此外，白三葉還是重要的優質豆科牧草之一，影響當地農牧業發展.因此，下一步將全面系統地調查和收集貴州、四川、廣西、新疆及云南等地區野生白三葉種質資源，增加其多樣性，為充分發揮白三葉資源的生態和經濟效益提供支持.

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